论文部分内容阅读
黑蒜是新鲜大蒜在一定的温度和湿度条件下加工而成的大蒜深加工产品,具有黑色的外观、软弹的质地、酸甜的口感、独特的风味以及显著的生物活性。前期研究发现,黑蒜在高温高湿加工过程中,主要发生Maillard反应等非酶褐变反应、大分子物质的降解反应和氧化反应等化学反应,然而该过程是否有微生物的参与以及微生物发挥何种作用的研究鲜见报道。目前通过“高温熟化”制作黑蒜,能耗高,质量安全指标不稳定,能否利用微生物来加快反应进程,提高产品品质还有待于研究。本研究通过“微生物群落结构分析-内生菌株特性研究-黑蒜品质形成的影响-发挥作用的潜在机制”路线,采用纯培养方式结合多基因位点系统发育树和高通量测序技术对黑蒜加工过程中的微生物进行探究,明确微生物的群落结构和变化规律;通过对纯培养过程中分离鉴定出的优势大蒜内生菌株进行生长特性、发酵特征的研究,阐明黑蒜自然发酵过程中微生物对加工进程和品质形成的影响;通过对内生菌分泌的果聚糖水解酶进行生产条件、分离纯化方式、酶学特征及其对Maillard反应的影响的研究,阐明微生物影响黑蒜品质形成的作用机制。主要研究结果如下:1.黑蒜加工过程中大蒜内生菌的分离与鉴定根据形态特征、生理生化特性和系统发育分析结果,从大蒜和黑蒜中分别鉴定出7种芽孢杆菌,其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicus）是大蒜和黑蒜中的主要内生菌。黑蒜加工过程中总菌和大蒜内生菌数量均呈现先急剧下降,然后迅速上升,最后缓慢降低的趋势。根据表型表征结合gyr A-rpo B-16S r DNA多基因位点的系统发育树,77株大蒜内生菌被成功鉴定,枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）是纯培养方式下黑蒜加工过程的优势菌株。因此大蒜内生菌存在于黑蒜的加工过程。2.黑蒜加工过程中微生物的群落结构与变化规律采用Illumina Mi Seq TM高通量测序技术对黑蒜加工样品的细菌16S r DNA V3–V4高变区进行测序,从20个样品中总共产生1247个OTUs。随着加工时间的延长,样品的Alpha多样性逐渐升高,到8 d和10 d达到最高,随后略有降低。黑蒜加工样品的微生物组主要由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）4种菌门,以及栖热菌属（Thermus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、链球菌属（Streptococcus）和短波单胞菌属（Brevundimonas）4种菌属组成,并且芽孢杆菌占有较高的比例。Pearson相关性分析表明,加工温度和黑蒜的化学成分（如大蒜素、还原糖、总酚和总酸）显著影响微生物的群落结构。3.优势大蒜内生菌的生长特性和发酵特征及其对黑蒜品质形成的影响从黑蒜加工过程中分离得到的大蒜内生菌中选取4种优势芽孢杆菌进行特性研究,所选菌株具有相似的生长曲线,表现出一定的耐热性（50°C时营养细胞大于7 Lg CFU/m L）和较宽的p H生长范围（5?9）。黑蒜加工过程中产生的大蒜素和5-HMF导致菌株的生长密度分别下降了7.45%?69.73%和17.78%?30.68%,枯草芽孢杆菌具有较强的耐受性。4种菌株均具有中性蛋白酶（7.70?31.91 U/m L）、碱性蛋白酶（3.32?16.72U/m L）和果聚糖水解酶（0.65?0.81 U/m L）活性,枯草芽孢杆菌具有最强的酶分泌能力。在黑蒜自然发酵过程中,枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的接种能够加快黑蒜的褐变速率,增强褐变强度（0.81%?2.78%）,这表明大蒜中的优势内生菌株影响了黑蒜品质的形成。与对照组相比,枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌接种后,黑蒜样品的还原糖含量增加了27.70%?99.47%,这可能是其加快黑蒜的褐变速率,促进黑蒜品质形成的主要原因。主成分分析表明,不同加工时间的黑蒜样品具有显著差异,但是不同菌株的接种引起的差异有限。4.枯草芽孢杆菌分泌的果聚糖水解酶的分离纯化与酶学表征培养基类型、碳源、氮源、培养温度和p H、果聚糖的浓度和培养时间对4种优势内生菌株的果聚糖水解酶分泌活性具有显著影响。经过培养条件优化后,果聚糖水解酶分泌能力最强的枯草芽孢杆菌被用于酶的生产与纯化。枯草芽孢杆菌的发酵上清液经过饱和硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-100凝胶色谱柱的分离纯化共获得3种果聚糖水解酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ和酶Ⅲ）,比活力分别为270.24 U/mg、168.91 U/mg、202.68 U/mg。3种果聚糖水解酶均为外切水解酶,分子量分别为92 k Da、20 k Da和10 k Da。酶Ⅰ具有较高的热稳定性和p H稳定性,具有最小的Km值（42.55 mg/m L）和最大的Vmax值（15.77 U/m L）,并且活性受到一些金属离子、化学试剂和蛋白酶的影响。分子对接分析发现,外切果聚糖水解酶与果聚糖的主要作用方式为氢键相互作用,底物结合口袋中距Nystose配体分子3?以内的氨基酸残基共6个。5.枯草芽孢杆菌分泌的果聚糖水解酶对Maillard反应的影响及潜在机制通过果聚糖-组氨酸模型研究了3种果聚糖水解酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ和酶Ⅲ）对Maillard反应速率和强度的影响。与对照组相比,热加工15 d时3种果聚糖水解酶使Maillard反应模型的褐变程度显著增加了3.60倍、2.00倍和1.27倍,使类黑精含量显著增加了4.28倍、1.74倍和1.33倍。化学成分分析表明,3种果聚糖水解酶使Maillard反应模型的还原糖含量显著增加了0.62倍?2.69倍,组氨酸含量显著降低了2.42%?40.71%,伴随着5-HMF、p H、紫外吸收和荧光光谱的强烈变化。综上所述,枯草芽孢杆菌等优势大蒜内生菌可以通过果聚糖水解酶促进多糖的降解进而加速黑蒜褐变,促进黑蒜品质的形成。