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第一部分WNT4为micro RNA497的靶基因,且在结直肠癌中表达增高目的:研究结直肠癌组织中WNT4的表达含量,探讨WNT4及micro RNA497之间的表达关系。方法:1.构建micro RNA497基因敲除鼠,将野生鼠（WT）及基因敲除鼠（KO）的结直肠组织进行二代测序,并利用免疫组化检测结直肠中WNT4表达含量,ELISA检测野生鼠（WT）及基因敲除鼠（KO）血清中WNT4含量。2.以人结直肠癌细胞Lo Vo与HCT 116作为实验对象,分别转染Normal Control及micro RNA497 mimics（与micro RNA497具有相同作用的模拟物）,用Real-time PCR和Western blot法检测不同组WNT4的m RNA与蛋白表达水平;利用双荧光素酶报告报告基因实验验证micro RNA497与WNT4之间的结合关系。3.Real-time PCR检测人体结直肠癌及癌旁组织中micro RNA497及WNT4的m RNA表达量,免疫组化、Western blot检测人体结直肠癌及癌旁组织中WNT4的表达水平。4.收集健康人、结直肠癌病人手术前及手术后的血清,ELISA检测WNT4的血清表达水平。5.收集新鲜的结直肠癌及癌旁组织,1 m L DME/F12培养基（无血清）培养过夜后收集上清,ELISA检测其中WNT4的分泌量。结果:1.Real-time PCR及凝胶电泳实验均证实micro RNA497基因敲除鼠构建成功;野生鼠（WT）及micro RNA497基因敲除鼠（KO）的结直肠组织进行二代测序结果表明micro RNA497的KO中WNT4表达升高,且免疫组化也显示micro RNA497的KO中WNT4表达升高;野生鼠（WT）及micro RNA497基因敲除鼠（KO）的血清ELISA结果KO鼠中WNT4异常升高（P=0.0244）。2.人结直肠癌细胞Lo Vo与HCT 116转染micro RNA497 mimics后WNT4的m RNA与蛋白表达水平均降低,相比于Control组;且双荧光素酶报告报告基因实验证实WNT4是micro RNA497的一个靶基因。3.人体结直肠癌及癌旁组织的QPCR结果显示10对标本中micro RNA497的m RNA水平在癌组织中均降低,而WNT4在相同的10对标本中9对均增高,且WNT4与micro RNA497的表达呈负相关（P＜0.001,R2=0.7117）。Western blot及免疫组化结果显示相比于癌旁正常组织,WNT4在结直肠癌中表达升高。4.ELISA结果显示结直肠癌病人术前血清中WNT4含量远远高于正常健康人（P＜0.01）,且23个结直肠癌病人中21个的术后WNT4含量相较于术前,均降低（P＜0.05）。结直肠癌病人血清中WNT4含量与TNM T分期（55.94 pg/m L vs.88.08 pg/m L;P=0.0293）,肿瘤远处转移（71.73 pg/m L vs.111.1 pg/m L;P=0.0428）,TNM分期（66.35 pg/m L vs.94.57 pg/m L;P=0.0464）,肿瘤大小（59.38 pg/m L vs.96.60 pg/m L;P=0.0087）等相关。且相比于传统肿瘤标志物CA199和CEA,WNT4在结直肠癌中更敏感。5.新鲜的结直肠癌及癌旁组织分泌的上清,经ELISA检测后显示,肿瘤组织分泌的WNT4含量远高于癌旁（P＜0.05）。结论:1.WNT4在micro RNA497基因敲除鼠（KO）的结直肠组织中表达增高。2.WNT4是micro RNA497的一个靶基因。3.在人体结直肠癌组织中WNT4的表达量增高,且与micro RNA497的表达呈负相关。4.结直肠癌患者血清中WNT4的含量远远高于健康对照组,手术切除后血清中WNT4含量下降。WNT4血清含量与结直肠癌患者的TNM T分期,TNM M分期,TNM总分期,肿瘤大小等相关。5.WNT4可由结直肠癌组织高分泌。第二部分WNT4对结直肠癌细胞的机制作用研究目的:探讨WNT4在结直肠癌细胞的作用。方法:1.人结直肠癌细胞Lo Vo、HCT 116转染TOP-Flash＆FOP-Flash质粒,以检测外源性重组WNT4蛋白是否可以激活WNT经典通路;在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,加入外源性重组WNT4蛋白（100ng/m L）孵育不同时间,Western blot检测β-catenin、AXIN2、E-cadherin、ZO-1、核β-catenin、核AXIN2的表达;免疫荧光检测β-catenin、AXIN2的表达。2.将培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞,分为DMSO、WNT通路的抑制剂ICG-001（25μM）、ICG-001（25μM）+WNT4蛋白（100ng/m L）三组,TOP/FOP实验及Western blot检测WNT通路的抑制情况。3.在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,外源性重组WNT4蛋白（100ng/m L）预处理24 h后,用Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭能力。4.在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,转染Normal Control、WNT4-si RNA1、WNT4-si RNA2后培养48 h,QPCR检测WNT4的敲低情况后,Western blot检测β-catenin、AXIN2、E-cadherin、ZO-1、核β-catenin、核AXIN2的表达。5.构建WNT4过表达慢病毒,QPCR检测WNT4的过表达情况后,TOP/FOP实验检测细胞内过表达WNT4是否可以激活WNT经典通路。6.利用WNT4敲低稳转细胞株,裸鼠尾静脉注射建立肿瘤转移模型,查看转移情况。7.利用WNT4敲低及过表达稳转细胞株,裸鼠皮下注射建立裸鼠皮下移植瘤模型。结果:1.外源性重组WNT4蛋白可以激活人结直肠癌细胞Lo Vo、HCT 116中的WNT经典通路。在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,加入外源性重组WNT4蛋白（100ng/m L）孵育后呈时间梯度诱导细胞内β-catenin、AXIN2、核β-catenin的蛋白水平表达量增加;核AXIN2呈时间梯度表达量增加后,在1h达到最高,随之下降;E-cadherin、ZO-1呈时间梯度表达量降低。在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,加入外源性重组WNT4蛋白（100ng/m L）孵育后免疫荧光检测发现细胞核内β-catenin、AXIN2的表达量增加。2.将培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞,分为DMSO、WNT通路的抑制剂ICG-001（25μM）、ICG-001（25μM）+WNT4蛋白（100ng/m L）三组,TOP/FOP实验及Western blot结果均证实WNT4蛋白不能激活被ICG-001抑制的WNT通路。3.在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,外源性重组WNT4蛋白（100ng/m L）预处理24 h后,细胞的迁移及侵袭能力均增强。4.在培养的Lo Vo、HCT 116人结直肠癌细胞中,转染Normal Control、WNT4-si RNA1、WNT4-si RNA2后培养48 h,QPCR证实WNT4的m RNA水平被敲低,Western blot检测β-catenin、AXIN2、核β-catenin、核AXIN2的蛋白水平表达降低,而E-cadherin、ZO-1表达增高。5.构建WNT4过表达慢病毒,QPCR证实WNT4的m RNA水平增高,TOP/FOP实验证实细胞内过表达WNT4可以激活WNT经典通路。6.利用WNT4敲低稳转细胞株,裸鼠尾静脉注射建立肿瘤转移模型,发现WNT4敲低稳转组的肝重/体重以及肝转移数目均比对照组低。7.利用WNT4敲低及过表达稳转细胞株,裸鼠皮下注射建立裸鼠皮下移植瘤模型,两组结果均未发现统计学意义。结论:1.WNT4可以激活人结直肠癌细胞Lo Vo、HCT 116中的WNT经典通路。2人结直肠癌细胞中敲低WNT4可以抑制WNT经典通路。3.WNT4敲低可以抑制裸鼠体内细胞转移。第三部分WNT4对结直肠癌间质中成纤维细胞的机制作用研究目的:探讨WNT4在结直肠癌间质中成纤维细胞中的作用。方法:1.将第二部分中的皮下结节进行免疫荧光,检测其中α-SMA的表达。2.收集新鲜的结直肠癌及癌旁组织,消化并分离其中的激活的成纤维细胞（CAF）和正常的成纤维细胞（NF）,并利用流式细胞术检测细胞表面CD31,CD45,and CD329以验证是否为成纤维细胞。3.悬浮微球试验比较Lo Vo Scramble和Lo Vo sh-WNT4组、SW480 WNT4-vector和SW480 WNT4-HA组中微球形成能力;在正常的成纤维细胞中加入外源性WNT4,凝胶收缩试验检测WNT4的凝胶收缩能力。4.Western blot以及免疫荧光检测成纤维细胞加入外源性WNT4蛋白后,α-SMA及fibronectin的表达。5.在正常的成纤维细胞中加入外源性蛋白WNT4,免疫荧光检测核内β-catenin的表达。6.将正常的成纤维细胞分为DMSO、DMSO+WNT4、ICG-001、ICG+WNT4四组,Western blot检测α-SMA及fibronectin的蛋白表达水平,免疫荧光检测α-SMA的表达,悬浮微球试验比较各组成球能力,凝胶收缩试验检测各组凝胶收缩能力。结果:1.免疫荧光结果显示,Lo Vo sh-WNT4组α-SMA表达降低,SW480WNT4-HA组α-SMA表达升高。2.流式细胞术确认分离的细胞为成纤维细胞。3.悬浮微球试验结果显示Lo Vo Scramble组比Lo Vo sh-WNT4组成球能力强、SW480WNT4-vector比SW480 WNT4-HA组中微球形成能力弱;凝胶收缩试验结果显示加入外源性WNT4促进了凝胶收缩。4.Western blot以及免疫荧光检测成纤维细胞加入外源性WNT4蛋白后,α-SMA及fibronectin的蛋白表达水平增加。5.在正常的成纤维细胞中加入外源性蛋白WNT4,免疫荧光显示核内β-catenin的表达增加。6.将正常的成纤维细胞分为DMSO、DMSO+WNT4、ICG-001、ICG+WNT4四组,Western blot结果加入外源性WNT4蛋白后α-SMA及fibronectin的蛋白表达水平增加,但加入10μM ICG-001后,WNT4蛋白将不能再使α-SMA及fibronectin增高,免疫荧光、悬浮微球试验、凝胶收缩试验的结果同时验证了Western blot的结果。结论:WNT4可以激活结直肠癌间质中成纤维细胞