第一部分:理论研究西方医学中定义的支气管哮喘归属于中医学“哮病”的范畴,因患者先天禀赋异常、痰浊内伏、伏痰引动而发病。2012年《支气管哮喘中医诊疗专家共识》中将哮病的疾病阶段分为:发作期、慢性持续期、缓解期。哮病常常继发于外感、饮食不当、情志失常、劳累困倦等,痰阻气道、肺失肃降、气道挛急,病人会出现哮鸣、喘息的突然发作。临床上发作期的哮病多以热哮证、风哮证最常见。本文所探讨的定喘汤出自《摄生众妙方》,是传统治疗热哮证的经典名方。笔者通过多个数据库检索发现各地专家在临床上应用定喘汤治疗热哮证疗效确凿,定喘汤中的主要组成药物黄芩也被证明具有抗炎平喘的作用。但是定喘汤以及黄芩平喘机制、作用靶点尚不明确,因此基于网络药理学研究筛选出定喘汤治疗哮喘的可能作用靶点,选择黄芩的单体成分黄芩苷为代表,研究其抗炎平喘机制,为进一步揭示定喘汤的作用通路、靶点提供依据,也为进一步研发新型有效的治疗热哮证的中药复方打下良好基础。第二部分:基于网络药理学研究定喘汤治疗支气管哮喘的可能作用靶点目的建立定喘汤活性成分-作用靶点、蛋白相互作用、靶点相应的生物功能和通路网络,探讨定喘汤的作用机理及作用靶点。方法从中药系统药理学数据库、中药信息数据库中筛选定喘汤治疗支气管哮喘的活性成分,筛选的ADME条件为口服生物利用度≥30%,血脑屏障通透率>0.3,类药性>0.18。通过中药系统药理学数据库、SEA和The Binding Database收集定喘汤活性成分可能的靶点蛋白信息,利用UniProt软件转化为靶点基因信息。通过TTD、OMIM数据库、GAD、Drugbank和遗传药理学和PharmGkb数据库获得支气管哮喘相关靶点信息。通过Cytoscape软件获得定喘汤活性成分关于支气管哮喘的靶点,构建药物-靶标-疾病网络、蛋白与蛋白相互作用(PPI)网络,采用DAVID数据库对定喘汤活性成分关于支气管哮喘的靶点进行GO分析、采用KEGG分析定喘汤作用于哮喘的通路富集情况。结果(1)收集筛选到52个无重复的定喘汤活性化合物,通过数据库收集到52个活性化合物的100个靶点蛋白信息。(2)通过Venny2.1.0软件与哮喘相关靶点542个取交集分析获得54个定喘汤作用于哮喘的潜在靶点。(3)利用GO分析,定喘汤由4个族群的生物过程参与支气管哮喘,分别是信号传导、炎症反应和免疫作用、蛋白质降解、蛋白磷酸化的分类调控。(4)定喘汤参与支气管哮喘主要通路有PI3K-Akt信号通路、ERK信号通路、Notch信号通路、TGF-β信号通路、mTOR信号通路、MEK-STAT信号通路、GAS-STINGT信号通路、细胞受体信号通路、NF-kappa B信号通路、MAPK信号通路、Sonic hedgehog信号通路。结论定喘汤与支气管哮喘关系密切,能通过多通路、多靶点、多活性物质控制支气管哮喘的发生发展,具有促进信号传导,抑制炎症反应,促进蛋白分解等潜在作用。第三部分:黄芩苷对小鼠气道炎症的抑制及重塑作用目的支气管哮喘作为一种以慢性气道炎症、气道高反应性以及气道重塑为特征的慢性的呼吸系统疾病,严重影响了患者的生活质量,加重了社会的经济负担。黄芩苷是一种具有抗炎、抗肿瘤作用的中药单体,但其在哮喘中的作用及机制尚不完全清楚,本部分主要探究黄芩苷对小鼠气道炎症的抑制及气道重塑的作用。方法建立卵清蛋白(OVA)诱导C57bL/6小鼠哮喘模型,分别采用Elisa法、Western blot法和流式细胞术检测炎性因子原代、蛋白表达和炎性细胞群。然后,制备小鼠哮喘气道重塑模型,造模后将小鼠按体质量随机分为6组,即空白组(Control,n=10)、模型组(Model,n=10)、地塞米松组(DS,n=10)、黄芩苷低剂量组(LD,n=10)、黄芩苷中剂量组(MD,n=10)、黄芩苷高剂量组(HD,n=10),采用免疫组化法检测各组小鼠肺组织匀浆中α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)及气道组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白的表达量;用RT-PCR检测气道平滑肌(ASM)中p-ERK1/2的mRNA水平。本研究采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。结果(1)与对照组相比,吸入OVA后哮喘小鼠的总细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞计数均显著增加。此外,黄芩苷以剂量依赖的方式给药,上述细胞总数和分化细胞数的增加明显减弱。(2)与对照组相比,不同浓度(2.5mg/kg、5mg/kg和1Omg/kg)的乙酰胆碱刺激后,OVA激发组的RI值显著增加。此外,黄芩苷剂量依赖性地降低OVA诱导的RI升高,尤其是40mg/kg浓度的黄芩苷。与对照组相比,OVA激发组Cdyn值有明显下降趋势。黄芩苷或地塞米松可有效缓解OVA诱导的Cdyn下降。(3)OVA致敏后,IL-4、IL-5、IL-6、IL-13和TNFα水平均显著升高,而IFN-γ水平在不同治疗组间无明显差异。黄芩苷和地塞米松均能明显抑制OVA诱导的细胞因子表达增加。(4)与对照组相比,OVA诱导组的血清IgE和IgG1水平均显著升高。同时,黄芩苷或地塞米松能有效地降低OVA致敏后血清IgE和IgG1水平的升高。然而,不同治疗组小鼠的血清IgG2a水平没有显著差异。(5)OVA吸入组气道上皮细胞JAK、STAT6、p-STAT6均较对照组有一定程度的升高。更重要的是,随着不同浓度黄芩苷或地塞米松的摄入,卵蛋白致敏的JAK、STAT6和p-STAT6水平的升高将不同程度地降低。(6)空白组的气道上皮比较平整,炎性细胞浸润不可见,气管壁正常。模型组小鼠的肺组织支气管变得狭窄,并且有变形发生,支气管管壁增厚,粘膜皱襞增加,炎性细胞浸润明显,并呈现堆积现象。与模型组相比,地塞米松组以及黄芩苷高、低剂量组患者的肺组织病理学减轻,但以地塞米松组改善效果最佳。(7)与空白组相比,模型组小鼠肺组织p-ERK1/2蛋白表达明显升高。与模型组相比,地塞米松组以及黄芩苷高、低剂量组小鼠肺组织p-ERK1/2蛋白表达明显下降。(8)模型组ERK1/2mRNA表达与空白组对比显著增多。与模型组相比,地塞米松组以及黄芩苷高、低剂量组的ERK1/2 mRNA表达明显下降。(9)与空白组相比,模型组小鼠肺组织α-SMA蛋白表达显著增加。与模型组相比,地塞米松组以及黄芩苷高、低剂量组的α-SMA蛋白表达下降明显。(10)模型组TGF-β1蛋白表达与空白组比较明显增加,地塞米松组以及黄芩苷高、低剂量组的TGF-β1蛋白表达均比模型组显著降低。结论(1)黄芩苷能松弛小鼠支气管平滑肌,对抗乙酰胆碱引起的支气管痉挛收缩,减轻哮喘症状,降低炎症因子的表达。进一步揭示了黄芩苷抑制JAK/STAT6通路减轻气道炎症的分子机制,为临床治疗哮喘提供了潜在的指导。(2)黄芩苷可能是通过降低TGF-β1的蛋白表达,影响了 α-SMA的合成,并影响ERK信号传导通路,下调ERK1/2 mRNA含量,从而减轻气道炎症,抑制气道细胞质的纤维化,从而改善气道重塑,但具体的分子作用机制仍需进一步研究。