本论文分为两个部分,第一部分是研究线粒体内膜Tim23通道蛋白转运前体蛋白的分子机制,第二部分是线粒体内膜Mba1蛋白结合核糖体及稳定新生肽链的分子机制。第一部分:线粒体含有1000多种蛋白且其中约99%的蛋白是由细胞核基因组编码,并以前体蛋白的形式在细胞质核糖体上翻译合成。TIM23复合物是介导部分前体蛋白定向转运至线粒体基质,或部分插入到线粒体内膜的转运分子机器。酿酒酵母Tim23是由222个氨基酸残基组成的α-螺旋蛋白,是作为TIM23复合物的核心亚基而形成前体蛋白跨膜转运通道。研究预测Tim23蛋白位于膜间隙的N端1-100氨基酸残基区域,存在有能特异结合前体蛋白的N端前导肽的卷曲螺旋区域(Coiled-Coil Motif),体外纯化的Tim23能够形成蛋白通道并且在膜电势差驱动下,能够特异性结合并转运前体蛋白细胞色素c氧化还原酶四亚基的前导肽(pCoxIV)。目前对Tim23通道蛋白在生理状态下如何完成蛋白转运有了些初步的研究认识,但是关于Tim23如何在前体蛋白及膜电势差存在下如何工作的分子机制,却由于Tim23通道的三维结构的缺失而未有深入的理解。我们利用液相核磁共振技术解析得到Tim23-pCoxIV复合物的溶液三维结构,并发现了一些新颖的结构特征。发现Tim23蛋白N端膜外区域包含一个特异性识别并结合前体蛋白的Coiled-Coil Motif。其次是Tim23通道蛋白的通道开关采用了双开关的控制机制。包括存在于内膜通道上方起到电压感受器作用的保守的盐键区域,以及位于通道开口处起到空间位阻的作用的具有较大侧链的色氨酸及酪氨酸残基。最后是通道内分布的亲水性氨基酸残基形成水溶液环境的蛋白质转运通道。基于体外电生理分析及蛋白三维结构特点,我们提出了Tim23通道蛋白跨膜转运前体蛋白至线粒体基质的分子机制模型,提供了关于前体蛋白转运新的深入理解的结构基础。第二部分:酿酒酵母Mba1是位于线粒体内膜上的以α-螺旋为主的外周膜蛋白。蛋白大部分区域面向基质,作为线粒体核糖体受体蛋白,Mba1能直接与核糖体大亚基新生肽链出口附近的区域相结合,在转运新生肽链进入内膜的过程中发挥作用。另外Mba1也起到分子伴侣的作用,稳定保护新生肽链。目前关于线粒体DNA编码的前体蛋白转运至内膜的过程了解较少,Mba1的三维结构也尚未被解析,关于Mba1是如何特异性结合受体核糖体及其协助转运前体蛋白的分子机制都是未知的。我们利用液体核磁共振技术解析获得了 Mba1蛋白在自由状态下的溶液三维结构,同时通过冷冻电镜技术解析了 Mba1蛋白与核糖体-新生链复合物的复合体三维结构,通过比较分析Mba1蛋白在自由与结合状态下的构象变化,从而阐明Mba1结合受体及转运前体蛋白的分子机制。目前获得了 Mba1初始溶液三维结构和9.8埃的Mba1-核糖体-新生肽链的初始电镜复合物结构,发现蛋白能够正确结合到核糖体新生肽链出口处,目前由于低分辨率无法看到精细的结构细节,后续的实验与结构精修仍在推进中。