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组织损伤与修复是目前外科领域研究的热点课题,在临床上修复障碍主要表现为愈合迟缓性皮肤伤口(delayed healing wound, DHW),如糖尿病并发皮肤溃疡、静脉性小腿溃疡和压迫性皮肤溃疡等。创面局部的炎症反应是创面愈合或组织修复的基础,没有创面局部的炎症反应就不可能有创伤愈合过程的启动和完成。但是过度的炎症反应和低下的免疫应答都可导致伤口的迁延不愈。本研究在北京中医医院临床有效方剂回阳生肌膏、回阳生肌散和回阳生肌薰药捻的基础上,根据其益气温阳活血通络的组方原则,选用黄芪多糖、桂皮醛、麝香酮和川芎嗪组成中药单体复方疡愈涂剂(YYTJ),利用小鼠免疫抑制复合皮肤伤口(immunosuppressive and skin wound,ISW)模型,在整体、细胞、分子水平上研究 YYTJ 对DHW 炎症阶段的免疫调节作用及分子机制。结果如下:1 整体试验1.1 免疫抑制复合皮肤伤口模型的复制-阳虚型愈合迟缓性皮肤伤口 以氢化考的松处理小鼠造成免疫抑制状态,用特制打孔器在鼠背打一圆孔,采取全厚皮切除术,复制ISW模型。观察小鼠创伤前后一般状况并测定创伤后3d、7d伤口面积;创伤后1d、3d、7d 取伤口组织经 HE 和 Massson 染色观察创面的组织学变化;MTT 比色法检测模型组小鼠脾淋巴细胞增殖功能,并用中性红比色法测定腹腔巨噬细胞吞噬功能。结果显示:⑴使用氢化考的松 7 天后,模型组小鼠出现萎靡不振、毛色无光泽、弓背少动、反应迟钝、体重下降等现象,复合皮肤损伤后,以上症状加重,出现蜷缩畏寒等症状,中医辩证符合阳虚型创面。⑵创伤后3d单纯损伤对照组与模型组伤口面积无明显差异,7d模型组伤口面积明显大于对照组(p<0.01)。模型组创面炎细胞浸润和新生胶原均少于对照组。⑶复合皮肤损伤前,氢化考的松能抑制ConA、LPS诱导的小鼠T、B淋巴细胞增殖(p<0.01)和小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力(p<0.01),复合皮肤损伤1d和7d后,与对照组相比模型组小鼠T、B淋巴细胞增殖(p<0.01,p<0.05)和腹腔巨噬细胞的吞噬能力(p<0.01)均受到抑制。结果提示:免疫抑制小鼠复合皮肤损伤后仍处于免疫抑制状态,创面愈合延迟,主要症状表现为阳虚型。1.2 疡愈涂剂对免疫抑制复合皮肤伤口小鼠创面的愈合作用及机制研究 通过测定模型组小鼠伤口面积和愈合率,HE和Massson染色观察创面的组织学变化,免疫组化法检测创面局部TGF-β1和 CD68表达,放免法检测小鼠创面局部IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平,观察疡愈涂剂高(1.05g/L)、中(0.53g/L)、低(0.27g/L)三个浓度对小鼠ISW的愈合作用并探讨其作用的分子机制。结果显示:⑴用药后7d和10d与模型组相比,YYTJ 能够明显缩小小鼠创面面积(p<0.01,p<0.05),提高愈合率。⑵高浓度 YYTJ 能增加 ISW小鼠创面局部巨噬细胞的数量(p<0.01),中、低浓度组无明显差异。⑶用药后3d时YYTJ各<WP=4>II 疡愈涂剂对愈合迟缓性皮肤伤口的愈合作用及局部免疫调节机制研究浓度组 IL-1β水平明显高于模型组(p<0.01),7d 时无明显差异,10d 时高、中浓度组明显下降(p<0.01,p<0.05)。用药后3d YYTJ各浓度组IL-6水平明显降低(p<0.01),7d和10d时无明显差异。用药后YYTJ各浓度组3d时TNF-α水平无明显差异,7d 时明显升高,10d 时YYTJ 中、低浓度组明显下降(p<0.01)。3d 时 YYTJ 低浓度组 IL-8 水平明显升高(p<0.01),7d 时各浓度组无明显差异,10d 时低浓度组明显下降(p<0.05)。⑷促进创面局部 TGF-β1表达和胶原合成。结果提示:YYTJ 通过增加创面局部巨噬细胞数量;调节创面局部炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α水平,从而启动免疫抑制小鼠的局部炎症反应。进一步促进TGF-β1 表达、细胞增殖和胶原合成来加速创面愈合。2 体外实验2.1 几种外用中药成份对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖 的影响 用MTT法检测益气、温阳、活血、通络外用中药的有关成分对HUVEC增殖的影响。结果表明:黄芪多糖 9.75mg/L～2.5g/L 对 HUVEC 未表现出促进增殖作用;人参皂苷 Rh11.94mg/L～0.5g/L 促进 HUVEC 的增殖(p<0.05,p<0.01),增殖率为 33.33%～111.11%;人参皂苷Rg1 31mg/L抑制细胞增殖(p<0.05),抑制率为38.53%;鹿茸多肽1mg/L～0.5g/L明显促进HUVEC 的增殖,以10mg/L 作用最明显(p<0.01),增殖率为55.56%～133.33%;桂皮醛2g/L 促进 HUVEC 的增殖(p<0.05),增殖率为 26.62%;麝香酮 1g/L 明显抑制 HUVEC 的增殖(p<0.01),抑制率为55.56%;乳香水提物(生药)0.5kg/L～2.5kg/L明显抑制HUVEC的增殖(p<0.01),抑制增殖率为35.56%～55.56%;川芎嗪0.125g/L～0.5g/L明显抑制HUVEC的增殖(p<0.01),抑制率为 8.22%～17.22%。结果提示:益气温阳药物人参(Rh1)、鹿茸(鹿茸多肽)、肉桂(桂皮醛)促进HUVEC增殖;通络活血药物麝香(麝香酮)、乳香(乳香水提物)、川芎(川芎嗪)抑制HUVEC增殖。2.2 疡愈涂剂对白细胞与血管内皮细胞粘附影响的分子机制 用MTT法检测YYTJ对HUVEC活力的影响,用台盼蓝计数法检测YYTJ对人外周血中性粒细胞(PMN)活力的影响。结果显示:YYTJ在132.5 ug/ml以下浓度时对HUVEC 和PMN活力无影响(P>0.05)