谷氨酸棒状杆菌中香草醛脱氢酶基因的鉴定及功能研究

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香草醛应用普遍,是对自然环境有一定毒害作用的芳香族化合物。近年来,对于香草醛脱氢酶(VDH)的研究主要集中于革兰氏阴性细菌,尤其是假单胞菌属。相反,关于香草醛脱氢酶及相关基因在革兰氏阳性细菌中的报道极为有限。之前有研究表明在革兰氏阳性细菌菌中vdh的存在和表达调控跟革兰氏阴性细菌中不同。因而,研究该酶在革兰氏阳性细菌中的作用机制有极其重要的意义。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)能够利用包括香草醛在内的多种芳香类化合物作为唯一碳源和能源进行生长。根据序列比对和同源性分析,ncgl2578基因被认为是在谷氨酸棒杆菌中编码香草醛脱氢酶的基因,但目前并没有关于其功能方面的相关研究报道。本研究通过对ncgl2578基因的蛋白序列与已知的其他菌属中的vdh基因的蛋白序列进行系统发育树分析,发现谷氨酸棒杆菌中的VDH可能代表了香草醛脱氢酶家族的一个新的分支,说明对于该基因的研究有助于进一步的探索香草醛脱氢酶的功能和特点。随后构建了ncgl2578基因的突变菌株和互补菌株,并研究了香草醛脱氢酶缺失突变菌株降解芳香化合物能力。通过比较突变菌株,野生型菌株和互补菌株在以香草醛,3,4-二羟基苯甲醛,对羟基苯甲醛等多种芳香化合物作为唯一碳源的生长情况,发现缺失突变ncgl2578基因之后,突变株的生长状况远低于野生型菌株;当互补ncgl2578基因之后,互补菌株生长状况和野生型相差无几。以上结果表明ncgl2578基因是谷氨酸棒状杆菌降解香草醛,3,4-二羟基苯甲醛等芳香醛中所不可缺少的。为了进一步研究其功能,通过体外表达ncgl2578基因所编码的蛋白并利用HPLC研究该蛋白能分别催化香草醛和3,4-二羟基苯甲醛转化为香草酸和3,4-二羟基苯甲酸的反应,进一步证实了ncgl2578基因具有香草醛脱氢酶的催化作用。随后,对该蛋白的酶学特性进行了进一步的研究,包括分子量以及其活性状态下的聚合形态,最适温度,最适pH值,底物范围,Km值以及活性位点。通过SDS-PAGE检测发现其相对分子质量为50kDa左右,并且非变性胶检测和凝胶过滤层析实验检测出该蛋白在活性状态下,存在四聚体,三聚体,二聚体和单体等形式;通过酶的活性实验,表明该酶进行酶促反应的最适pH和最适温度分别为pH 7.0和30℃,能利用NAD+和NADP+作为辅酶因子催化反应;除了香草醛,该蛋白表现出了广泛的催化范围,包括3,4-二羟基苯甲醛,对羟基苯甲醛,邻苯二甲醛,肉桂醛,丁香醛,苯乙醛等。以上结果表明,ncgl2578基因所编码的蛋白具有香草醛脱氢酶的活性,广泛的底物催化活性,存在多个保守的催化位点,ncgl2578基因是谷氨酸棒状杆菌降解香草醛等芳香化合物所不可缺少的基因。最后,通过序列比对以及之前关于香草醛脱氢酶的相关研究,进一步分析保守氨基酸位点,并且通过定点突变,酶活分析和动力学等方法对各保守位点的功能进行了研究。结果发现:五个保守位点都影响VDHATCC13032蛋白与NAD+的相互作用;E199不影响VDHATCC13032蛋白与NADP+的结合;K180,E258,C292对VDHATCC13032蛋白与底物的结合有重要作用。总之,本研究将有助于进一步了解细菌香草醛脱氢酶的多样性和芳香族化合物在谷氨酸棒杆菌中的代谢途径。
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