目的黄精作为一种药食两用的中药材,在临床上有着广泛的应用。历史上黄精炮制方法众多,常见的有单蒸法、复蒸法、九蒸九曝等。至清代,“九蒸九曝”为黄精炮制的主流方法。由于“九蒸九曝”法工艺复杂、耗时长,为降低成本、节约时间,目前市售的制黄精多采用单蒸法或二蒸法。现代研究表明,黄精的蒸制时间及次数对黄精的化学成分有较大的影响,在蒸制25h左右(四制黄精),部分化学成分达到最大值,后呈下降趋势,而化学成分的变化对药效会产生什么影响,目前尚不明确,故本实验模拟“九蒸九曝”炮制古法,制得四制黄精与九制黄精,同时选择市售制黄精(符合浙江省炮制规范)作为本实验的研究对象,考察黄精不同炮制品化学成分上的差异,并结合药效学实验比较黄精不同炮制方法在药效上的差异,最后利用体外实验对较为少见的四制黄精进一步进行功效验证。为临床使用选择适宜的炮制品提供参考。方法1.黄精不同炮制品的制备及化学含量测定:模拟古法炮制(九蒸九曝)方法,炮制取得四制黄精与九制黄精。观察黄精4种不同炮制品(生黄精、市售黄精、四制黄精、九制黄精)的外观、色泽、气味及口感。烘干法测定含水量,热浸法测定醇溶性浸出物,蒽酮-硫酸法测定总多糖含量,还原糖含量。2.黄精不同炮制品对气阴两虚模型大鼠的药效研究:采用3因素(热性药灌胃、限食、负重游泳)连续造模2周建立气阴两虚大鼠模型。造模成功大鼠随机分为模型组、阳性组、市售黄精组、四制黄精组、九制黄精组(每组7～9只)。分别灌胃给予10g/kg黄精各炮制品水提物或阳性药(生脉饮),持续给药6周。给药期间观察大鼠体重、尾根部直径、面温、抓力、痛阈值、热成像等一般行为学指标。末次给药后,尾根部采血测血红蛋白体(Hb);眼眶静脉取血测血生化各项指标:肝功能(谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST))、肾功能(肌酐(Cr))、糖脂代谢(葡萄糖(GLU)、三酰甘油(TG))、蛋白水平(总蛋白(TP)、白蛋白(ALB));酶联免疫法(ELISA)法检测大鼠肌红蛋白(Mb)、血清免疫球蛋白(IgA、IgM)、环磷核苷酸(环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP))含量。给药6周后,停止造模与给药,无干预状态下恢复4周,观察体重变化,比较不同炮制品对气阴两虚模型大鼠停药后的恢复作用。3.四制黄精粗多糖保护人胚肺二倍体成纤维2BS细胞早熟性衰老的研究:取第一部分实验中炮制的四制黄精,采用超声提取法提取其粗多糖进行体外细胞实验。取30代(PD)2BS细胞用不同浓度四制黄精粗多糖(0.01、0.1、1mg/ml)进行处理,取部分处理2h后,再用H2O2处理70h;部分则持续培养72h。培养结束后,采用MTT法测定细胞活力,并测定2BS细胞β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色率。结果1.黄精不同炮制品的制备及化学含量测定:①不同方法炮制的黄精在外观、色泽、断面、气味、口感上均有差异。随着蒸制次数的增多,麻舌感消失,气味先香甜后略苦,断面和表面泽色均逐渐加深,转为漆黑色。②不同炮制品含水量差异较小,生黄精、市售黄精、四制黄精、九制黄精含水量分别为12.29%、14.00%、12.45%、1 1.77%。③不同炮制品醇溶性浸出物含量有较大差异,随着蒸制次数的增多,呈先上升后下降的趋势。生黄精、市售黄精、四制黄精、九制黄精醇浸出物含量分别为22.14%、46.78%、64.30%、53.63%。其中四制黄精浸出物含量最高。④生黄精与蒸制后的黄精总多糖含量有显著差异。生黄精、市售黄精、四制黄精、九制黄精的总多糖含量分别为7.31%、1.99%、1.51%、1.52%。黄精蒸制后,总多糖含量显著下降,随着蒸制次数的增多,含量逐渐稳定。⑤黄精不同炮制品的还原糖含量有较大差异,生黄精、市售黄精、四制黄精、九制黄精的还原糖含量分别为13.00%、14.43%、51.69%、37.00%。随着蒸制次数的增加,还原糖含量变化与浸出物含量变化趋势相似,先上升后下降,四制黄精还原糖含量最高。2.黄精不同炮制品对气阴两虚模型大鼠的药效研究:造模2周,与正常组比较,模型组大鼠平均体重为174.90g,正常组为355.22g,仅为正常组的1/2,出现气阴两虚证中形体消瘦的症状;大鼠游泳时间显著下降,平均游泳时间由22.14min降至5.47min,表现出气阴两虚证中体倦乏力、精神不振的症状。同时模型组GLU水平显著降低,面温显著上升,并表现出焦躁、敏感、易怒、毛色无华等气阴两虚症状,说明造模成功。给药6周,与模型组比较,黄精不同炮制品对气阴两虚模型大鼠的影响:①市售黄精能显著改善气阴两虚模型大鼠的一般体征(痛阈、面温、抓力、热成像)、血生化水平(AST、GLU、TG)、各蛋白水平(Mb、Hb)、免疫系统(IgA、IgM)、环核苷酸系统。②四制黄精能显著改善气阴两虚模型大鼠的一般体征(体重、尾根部直径、痛阈、面温、抓力、热成像)、血生化水平(ALT、AST、GLU、TG)、各蛋白水平(Mb、Hb)、免疫系统(lgA、IgM)、环核苷酸系统,并在停药后对大鼠的体重有较好的恢复作用。③九制黄精能显著改善气阴两虚模型大鼠的一般体征(体重、痛阈、面温、抓力)、血生化水平(ALI、AST、GLU)、肌红蛋白Mb、免疫球蛋白IgA。④在各项指标中,不同炮制品进行对比发现,市售黄精在提高血红蛋白与免疫球蛋白方面有一定优势;四制黄精在各项指标中均有一定效果,尤其在调节血脂代谢和改善体重方面表现最佳;九制黄精在改善肝功能,提高免疫球蛋白IgA方面的效果较佳。3.四制黄精粗多糖保护人胚肺二倍体成纤维2BS细胞早熟性衰老的研究:①四制黄精粗多糖0.01、0.lmg/ml剂量组均能延缓人胚肺二倍体成纤维2BS细胞自然衰老,促进细胞增殖。高剂量表现出轻微的抑制作用。②四制黄精粗多糖中剂量能抵抗亚致死量H2O2处理造成的2BS细胞衰老,减少细胞凋亡。低剂量有相似效果,但无显著性差异。高剂量则表现为相反效果。③四制黄精粗多糖中剂量能显著降低亚致死量H202处理2BS细胞的SA-β-gal染色阳性率。结论1.黄精不同炮制品(生黄精、市售黄精、四制黄精、九制黄精)的外观、色泽、气味、口感、浸出物含量、总多糖含量、还原糖含量均有较大的差异,其中总多糖含量生黄精最高,浸出物与还原糖含量四制黄精最高。2.黄精不同炮制品均能改善气阴两虚模型大鼠的一般体征(体重、抓力、尾根部直径、面温、热成像、痛阈值)、供氧能力(降低Mb、升高Hb)、肝功能(降低AST、ALT)及糖脂代谢(降低TG、升高GLU);增加血清IgA、IgM,调节环核苷酸系统(cAMP/cGMP 比值);帮助大鼠恢复体重。市售黄精在提高血红蛋白与免疫球蛋白方面有一定优势;四制黄精在各项指标均有一定疗效,尤其在调节血脂代谢和改善体重方面表现最佳;九制黄精在改善肝功能,提高免疫球蛋白A方面的效果比较突出。不同炮制品有各有优缺点,在临床使用过程中可以进行适当的选择。3.四制黄精粗多糖能抵抗亚致死量H202导致的细胞的早熟性衰老,对2BS细胞有较好的保护作用,并能延缓2BS细胞的自然衰老。