第一部分PIK3CD GOF对人体T细胞分化的影响目的:分析APDS综合征患者外周血T淋巴细胞及亚群表型变化,初步明确PIK3CD获功能突变对人体T细胞分化的影响,为进一步探讨APDS免疫缺陷机制提供一定的临床表型依据。方法:检测本中心招募的25例APDS患儿外周血T细胞AKT和mTOR靶蛋白S6磷酸化水平;并利用流式细胞术对其外周血T细胞不同亚群(如 TNaive、TCM、TEM、TEMRA、TFH、Th 和 Treg)比例和/或数量进行检测;此外,对APDS患者T细胞表面活化、耗竭和衰老等指标进行初步检测和分析。结果:本研究自2013年至2020年共招募25例来自22个无关家庭的APDS患儿(c.3063G>A,p.E1021K;杂合突变),以同龄健康儿童50例作为对照组。与健康对照组相比,APDS患儿外周血淋巴细胞数量明显降低,CD3+T细胞比例无明显变化,而T细胞数量明显下降。APDS患儿CD4+T细胞比例下降而CD8+T细胞比例升高,CD4/CD8呈现倒置。与同龄健康对照相比较,APDS患儿CD4+T和CD8+T细胞中,TNaive明显下降而TcM、TEM和TEMRA明显增高,其中CD8+TEMRA升高更为明显。其次,对T细胞亚群进行分析,结果显示APDS患儿Treg细胞比例明显下降,而TFH细胞比例增加;CD4+T细胞亚群中Th1比例升高而Th17比例显著下降。此外,对T细胞进行表型分析,发现APDS患儿T细胞表面活化标志物或蛋白,如HLA-DR、NKG2D、CD38和PD-1的表达比例和/或表达水平升高,而细胞静息指标CCR7和CD62L表达明显下调,且CD8+T细胞中衰老或老化指标CD57+比例显著升高。结论:与国外文献报道基本一致,PIK3CD(E1021K)功能获得性突变(Gain-of-function mutation,GOF)引起T细胞异常分化,表现为CD4+T细胞过多分化为TFH和Th1细胞;PIK3CD GOF患者外周血T细胞呈现过度活化状态。第二部分PIK3CD GOF对小鼠T细胞发育、分化和功能的影响目的:通过分析PIK3CDGOF小鼠T细胞发育、分化、增殖、凋亡和细胞因子表达等变化,初步明确PIK3CD GOF对小鼠T细胞体内外生物学行为的影响。方法:采用CRISP/Cas9技术成功构建PIK3CD GOF定点突变小鼠模型;利用Western blot和免疫共沉淀分析小鼠T细胞相关信号通路变化;通过流式细胞术分析小鼠胸腺和外周淋巴组织T细胞及其亚群变化,并体内外分析小鼠T细胞增殖、凋亡、存活、极化等功能和分泌功能性细胞因子水平变化。结果:经 DNA 测序证实 PIK3CD GOF(c.3072G>A,E1024K)小鼠模型构建成功;PIK3CD GOF小鼠脾脏T细胞PI3K-AKT-Fox01和mTOR-S6信号通路高度活化;小鼠脾脏T细胞中,PIK3CD E1024获功能突变不影响Ⅰ类PI3K家族调节亚基(P110α、P110β、P110γ和P110δ)和催化亚基P85α的表达,也不影响催化亚基P110δ和调节亚基P85 α的结合。与野生型WT小鼠相比较,PIK3CD GOF小鼠外周淋巴组织T细胞亚群中TNaive比例下降,而TEM细胞比例明显升高,并且随着鼠龄增大而逐渐加剧。其次,PIK3CD GOF小鼠脾脏或肠系膜淋巴组织(MLNs,Mesenteric lymph node)中 T 细胞表面 CD25、CD44 和 CD69 等活化标志物显著高于WT组;PIK3CD小鼠TNaive细胞中活化标志物CD44也明显高于WT组小鼠。骨髓嵌合(Bone marrow chimera)实验表明PIK3CD GOF对T细胞的发育影响并非完全受T细胞内在性因素调节。利用PMA和离子霉素、anti-CD3/28抗体激活T细胞后,PIK3CD GOF小鼠T细胞分泌细胞因子IFN-γ明显增高。此外,与WT组相比,anti-CD3/28抗体刺激的PIK3CD GOF小鼠TNaive细胞分泌细胞因子IFN-γ也显著增高,同时PIK3CD GOF组TNaive细胞表面活化标志物CD25、CD44和CD69也明显高于WT组。体内、外实验均表明PIK3CD GOF促进TNaive细胞增殖。体外CD4+ TNaive细胞极化实验表明,PIK3CD GOF促进CD4+ TNaive细胞向Th1细胞分化,而抑制其向Th17分化。结论:PIK3CD GOF 导致 T 细胞 PI3K-AKT-FoxO1 和 mTOR-S6信号通路高度活化;PIK3CD GOF促进TNaive细胞过度活化和增殖;PIK3CD GOF驱动TNaive倾向于Th1分化。第三部分PIK3CD GOF通过mTOR促进TNaive细胞活化和增殖目的:明确PIK3CD GOF是否通过mTOR调节TNaive细胞活化和增殖。方法:分选WT和PIK3CD GOF小鼠TNaive细胞,并分别给予PI3Kδ和mTOR特异性小分子抑制剂IC-87114和Rapamycin,分析TNaive细胞活化、增殖和分泌细胞因子水平变化。其次,体内给予各组小鼠Rapamycin,15天后,分析各组小鼠T细胞活化、增殖和相关表型变化。结果:IC-87114和Rapamycin体外作用后,TCR诱导的PIK3CD GOF组小鼠TNaive细胞活化、增殖和细胞因子IFN-γ分泌水平明显下降。其次,与对照PIK3CD GOF小鼠相比较,Rapamycin作用组小鼠增大的脾脏明显缩小,脾脏细胞数量明显下降,脾脏TNaive细胞升高而TEM细胞明显下降;并且T细胞增殖、活化和细胞因子的分泌水平也下降至WT水平。结论:体内、外PIK3CD GOF通过mTOR促进TNaive细胞活化和增殖,而抑制mTOR活性明显逆转PIK3CD GOF所致的TNaive细胞异常活化。第四部分PIK3CD GOF对小鼠TNaive细胞转录组水平的影响目的:分析PIK3CD GOF组小鼠CD4+ TNaive细胞转录组变化,为进一步明确PIK3CD GOF致TNaive细胞过度活化的调控机制提供线索。方法:阴性磁极分选WT(n=3)和PIK3CD GOF组小鼠(n=4)脾脏CD4+ TNaive细胞,提取RNA并检测其完整性,质检合格的RNA送第三方公司进行测序。利用DAVID数据库对差异基因进行Go和KEGG分析,并结合IPA分析,以明确差异基因富集信号通路。结果:与WT组小鼠脾脏CD4+ TNaive细胞mRNA转录组表达相比较,2307个基因在PIK3CD GOF组小鼠差异表达,其中1749个基因表达上调,而558个基因表达下调。Go分析两组之间差异基因显著富集于细胞周期和细胞分裂、细胞迁移和趋化、细胞活化、细胞因子和细胞因子受体和细胞代谢通路。KEGG分析表明差异基因与感染、炎症、自身免疫和代谢性疾病密切相关。进一步IPA分析表明差异基因中调节细胞生长、增殖、活化和代谢相关通路受PIK3CD GOF正向调控;并且差异基因所富集的信号通路与Th1细胞活化、TFH细胞分化、T细胞耗竭、IFN-γ和炎症过程密切相关。结论:PIK3CD GOF可能通过细胞生长和分裂、增殖、活化、代谢和转录等过程协同促进TNaive细胞活化。第五部分PIK3CD GOF促进TNaive细胞活化的糖代谢调控机制研究目的:通过分析TNaive细胞葡萄糖代谢方式,明确PIK3CD GOF对TNaive细胞葡萄糖代谢的影响。其次,体内外干预异常糖代谢方式,分析TNaive细胞活化水平,阐释PIK3CD GOF促进TNaive细胞活化的糖代谢调控机制。方法:检测APDS患儿T细胞大小和葡萄糖摄取水平。利用流式细胞术检测PIK3CD GOF小鼠TNaive细胞大小和糖摄取,并通过Seahorse对TNaive和TCR刺激活化的T细胞产酸能力和耗氧水平变化进行检测,利用QRT-PCR对T细胞糖酵解关键酶的mRNA表达水平进行检测,采用Western blot对T细胞糖酵解关键酶和核心调节转录因子蛋白表达水平进行检测。其次,体外给予不同组T细胞糖酵解抑制剂,分析T细胞活化、增殖和分泌细胞因子水平变化。此外,体内给予不同组小鼠糖酵解抑制剂2-DG,分析小鼠T细胞生长、增殖、活化和功能变化。结果:1.F18-FDG示踪PET-CT显示APDS患儿全身淋巴组织糖摄取显著增高(病理活检除外淋巴瘤),APDS患儿T细胞增大,葡萄糖摄取增多;2.PIK3CD GOF小鼠TNaive细胞体积明显增大。在anti-CD3/28诱导活化后,与WT组相比较,PIK3CD GOF小鼠T细胞体积也明显增大,葡萄糖摄取同样显著增多;3.体外抑制糖酵解能够明显抑制PIK3CD GOF组小鼠T细胞活化、增殖和细胞因子IFN-γ分泌;4.PIK3CDGOF组小鼠TNaive细胞葡萄糖储备水平增高,氧气消耗率下降;TCR短期诱导活化的PIK3CD GOF组小鼠TNaive细胞糖酵解增高;长期诱导活化后,细胞有氧氧化水平显著下降;5.PIK3CDGOF组小鼠TNaive细胞中葡萄糖酵解关键酶mRNA和蛋白表达高于WT组,并且PIK3CD GOF组小鼠TNaive或 Activated T细胞中转录因子myc、IRF4和HIF-1a也高于WT组;6.与未用药对照组相对比,2-DG体内作用45天后,PIK3CD GOF小鼠脾脏明显缩小,脾脏细胞数量降低;TNaive细胞升高而TEM明显降低;TNaive细胞CD44表达明显下降,且T细胞表面活化标志物CD25、CD44和CD69表达也明显降低;T细胞IFN-γ细胞因子表达降低至WT水平。然而,WT小鼠用药前后T细胞亚群比例和活化无明显差异。结论:PIK3CD GOF小鼠TNaive细胞糖利用明显增强,糖酵解容量升高而有氧氧化下降;体内外抑制升高的糖酵解能够逆转T细胞生长、活化、增殖异常,维持TNaive细胞稳态。这初步证实PIK3CD GOF通过升高TNaive细胞糖酵解水平而促进TNaive细胞稳态失衡和活化。