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第一部分PIK3CD获功能突变对γδT细胞功能影响及机制研究背景:磷酸肌醇3激酶-δ过度活化综合征(Activated phosphoinositide 3 kinaseδsyndrome,APDS)是由PIK3CD基因获功能突变引起编码蛋白PI3Kδ过度活化的一种原发性免疫缺陷病,以反复呼吸道感染、淋巴组织增生、自身免疫疾病和肿瘤易感性为主要表现。而γδT细胞作为一种在抗感染、抗肿瘤中发挥着重要作用的细胞,是否参与APDS发病,以及其中的作用和机制尚不得知。目的:本研究以APDS患者和PIK3CD基因获功能突变(PIK3CD gain of function,PIK3CD GOF)小鼠为模型,分析PIK3CD GOF对总γδT细胞及亚类的比例和数目、增殖、活化、凋亡、肿瘤杀伤功能的影响,并探讨其中可能的分子机制。方法:本研究收集16例未经过免疫抑制剂和激素治疗的初诊APDS患儿(c.3063G>A,p.E1021K;杂合突变)的外周血样本,提取单个核细胞,用流式细胞术分析γδT细胞比例及数目,并同正常同龄儿童参考值范围进行比较。同时构建有同源突变位点E1021K的PIK3CD GOF小鼠模型,用流式细胞术检测小鼠γδT细胞PI3K-AKT-m TOR通路磷酸化水平,γδT细胞数目和比例,各个亚群(CD27+、CD27-、Vγ1、Vγ4)比例,分泌的细胞因子(INF-γ、IL17、颗粒酶B、穿孔素),表达的活化分子(CD38,CD69,CD44,CD62L)。并进一步分析了PIK3CD GOF小鼠脾脏γδT细胞在TCRγδ刺激活化下的增殖、凋亡水平,分选出扩增后的γδT细胞来验证体内外杀伤黑色素瘤细胞的功能。同时,通过构建CD45.1-WT小鼠、CD45.1-PIK3CD GOF骨髓嵌合体小鼠模型,验证PIK3CD GOF对γδT细胞的影响是固有存在还是环境因素导致。此外,我们结合单细胞测序及普通转录组测序,利用生物信息学方法分析PIK3CD GOF对小鼠γδT细胞转录组的影响,并利用PI3Kδ抑制剂IC-87114、m TOR抑制剂雷帕霉素对小鼠进行体内外干预,检测它们对PIK3CD GOF小鼠γδT细胞的功能影响。结果:本研究发现尽管患儿均存在反复呼吸道感染,仍分别有5例、6例患儿外周血中γδT细胞比例和数目明显低于同龄儿童正常值下限。相比于WT小鼠,基础状态下PIK3CD GOF小鼠脾脏γδT细胞PI3K-AKT-m TOR通路磷酸化水平明显上调,γδT细胞比例减少,由于脾脏较WT小鼠明显增大,γδT细胞总数目增加,Vγ1和CD27-γδT细胞比例明显增加,Vγ4和CD27+γδT细胞显著减少,γδT细胞NKG2D的表达和分泌的IL-17明显减少,而穿孔素和颗粒酶B明显增多。且CD69及CD38活化分子表达增强,初始γδT细胞显著减少,而效应记忆γδT细胞显著增加。进一步用TCRγδ刺激活化后,γδT细胞增殖明显受抑制,同时凋亡明显增强,体内外杀伤黑色素瘤功能明显减弱,杀伤功能相关分子表达异常,包括NKG2D表达降低,主要分泌IFN-γ的CD27+γδT细胞亚群显著减少,虽然PIK3CD GOF小鼠γδT细胞分泌的颗粒酶B和穿孔素明显减少,但体外应用IC-87114或雷帕霉素均未能提升其分泌水平。此外,在骨髓嵌合体小鼠模型中,未刺激状态下,PIK3CD GOF小鼠较WT小鼠γδT细胞仍明显减少,CD38、CD69表达增强,初始γδT细胞明显减少,而效应记忆γδT细胞显著增加,而刺激活化后的γδT细胞的增殖及NKG2D表达明显下降。经过对单细胞测序及普通转录组测序的生物信息学分析,我们发现WT和PIK3CD GOF小鼠γδT细胞差异基因主要富集在细胞活化、分化、肿瘤、细菌病毒感染、免疫反应、端粒结合DNA、雷帕霉素敏感性通路上。体内注射雷帕霉素使整个脾脏体积减少,下调了PIK3CD GOF小鼠γδT细胞的S6(Ser235,236)磷酸化水平,改变γδT细胞比例、数目,及初始及效应记忆γδT细胞,而与注射雷帕霉素或生理盐水的WT小鼠无明显差异。体外使用IC-87114或雷帕霉素使γδT细胞比例增加,CD27+细胞增加而CD27-细胞减少,IC-87114还促进NKG2D表达。结论:相比于正常同龄儿童和WT小鼠,PIK3CD GOF使APDS患儿外周血及小鼠脾脏γδT细胞比例、数目和亚群比例异常。PIK3CD GOF小鼠γδT细胞PI3K-AKT-m TOR磷酸化水平明显升高。基础状态下PIK3CD GOF小鼠γδT细胞处于过度活化状态,而在TCRγδ刺激活化下增殖抑制、凋亡增强。同时,PIK3CD GOF通过抑制了γδT细胞分泌穿孔素和颗粒酶B、下调NKG2D表达,减少分泌IFN-γ的CD27+γδT细胞的分化,显著抑制了体内体外γδT细胞的黑色素瘤杀伤功能,但体外使用IC-87114并没有显著上调穿孔素和颗粒酶B的分泌水平,可能和使用时间和剂量不足有关。PIK3CD获功能突变对γδT细胞的影响是固有存在的。结合转录组测序提示PIK3CD GOF小鼠γδT细胞活化、分化、抗肿瘤、抗感染、对雷帕霉素敏感性及端粒结合DNA异常,我们在体内外使用雷帕霉素可以分别逆转γδT细胞S6(Ser235,236)的高磷酸化水平、基础状态下的过度活化及刺激活化后γδT细胞比例。第二部分WAS蛋白缺陷对非典型记忆B细胞的影响及机制研究背景:湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征(Wiskott-Aldrich syndrome,WAS)是由WAS基因突变引起WAS蛋白缺陷的一种X连锁原发性免疫缺陷病,该病以湿疹、血小板减少、反复感染、自身免疫性疾病和肿瘤易感性增高为特点且预后极差。而非典型记忆B细胞(atypical memory B cells,a MBCs)作为一种在慢性感染和自身免疫性疾病中起重要作用的细胞,WAS蛋白缺陷对a MBCs是否有影响及相关机制尚不得知。目的:分析WAS患者外周血中非典型记忆B细胞的表型及功能变化,并探讨可能的机制。方法:我们收集23例WAS患儿的临床资料及基因突变信息,采集患儿及正常同龄儿(Healthy controls,HCs)的外周血标本,提取外周血单个核细胞,用流式细胞术检测a MBCs的比例,分析WAS临床评分与a MBCs在成熟B细胞中比例的关系。同时检测了a MBCs和经典记忆B细胞(classical memory B cell,c MBCs)表面CD11c、Fc RL5、CXCR5、CXCR3、CD35、CD40、Ig G1,及胞内T-bet表达水平。我们利用磷酸化流式细胞术,检测WAS和HCs的a MBCs、c MBCs BCR信号通路下游的关键分子p-Syk,p-BLNK,p-PLCγ2的表达水平。此外我们用磁珠分选出B细胞,用IFN-γ+anti-kappa+anti-lambda体外诱导增殖,检测a MBCs和c MBCs的增殖、凋亡情况。并应用酶联免疫吸附测定法检测患儿及正常同龄人外周血中IFN-γ、BAFF、APRIL水平,用PMA和离子霉素刺激T细胞检测分泌IFN-γ的水平。结果:和HCs相比,WAS患儿外周血a MBCs细胞占成熟B细胞比例明显增加,c MBCs减少,且在WAS评分越高的患儿中,a MBCs比例越高。在WAS患儿中,相比于c MBCs,a MBCs高表达T-bet、CD11c、Fc RL5,低表达CXCR5、CD35、CD40和Ig G1,且a MBCs的p-Syk、p-BLNK及T-bet+a MBCs的Syk、BLNK、PLCγ2磷酸化水平均明显下降。同时,相比于c MBCs,WAS患儿a MBCs ki67表达更低,且活细胞比例更低、早期凋亡和晚期凋亡显著增强。HC和WAS病人a MBCs在无刺激剂情况下,ki67表达无明显差异,而在IFN-γ+anti-kappa+anti-lambda刺激下,WAS患者较正常人a MBCs ki67表达增强,且联用BAFF+IFN-γ+anti-kappa+anti-lambda刺激使ki67表达进一步升高。此外,相比于HCs,WAS病人CD4+T和CD8+T细胞分泌IFN-γ增多,血浆IFN-γ、BAFF水平明显增高,且a MBCs PLCγ2磷酸化水平较HCs a MBCs显著上调。结论:较HCs,WAS患儿外周血中a MBCs比例明显增高,且与WAS评分呈正相关。WAS病人a MBCs较c MBCs高表达T-bet、CD11c、Fc RL5,低表达CXCR5、CD35、CD40和Ig G1,且a MBCs较c MBCs BCR信号通路磷酸化水平降低,增殖减弱、凋亡增强。与HCs相比,WAS a MBCs在IFN-γ+anti-kappa+anti-lambda刺激下增殖更明显,加用BAFF可进一步促进增殖。因此WAS病人较HCs a MBCs比例更高原因可能是WAS病人较HCs T细胞分泌更多的IFN-γ,血浆IFN-γ、BAFF水平明显增高,且a MBCs BCR磷酸化水平显著上调所致。