阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神退行性疾病，也是最常见的一种痴呆病。在65岁以上的老年人中，AD的患病率约为10%。AD主要的神经病理改变包括细胞外的老年斑（其核心是β淀粉样蛋白，即Aβ）、胞内神经纤维缠结，以及选择性的神经元和突触联系的消失。AD的发病机制虽然复杂，但Aβ学说得到众多学者的公认，比较一致的观点是Aβ的低聚物及纤维在AD发病过程发挥关键作用，与其他因素共同引起AD一系列的病理过程。由于发病因素及病理机制复杂，目前尚无法对AD进行有效防治。目前在临床上虽有药物用于治疗AD，但疗效均不理想。因此，基于Aβ学说在AD发病中的重要作用，人们开始围绕通过减少Aβ的沉积设计新的药物及相应的治疗方法。但就目前的研究结果来看，其疗效仍不明确。需要寻找新的干预措施延缓甚至逆转AD的病程。白藜芦醇（Resveratrol）（反式-3,4,5’-三羟基均二苯代乙烯）是一种天然的多酚类化合物。目前已经发现在70多种植物中含有该化合物（如葡萄皮、坚果、石榴等）。此外，已经明确红酒中的白藜芦醇含量很高。研究证实白藜芦醇有着极为广泛的生物学作用，如心血管保护、抗癌、抗炎，以及神经保护等。早期的研究结果显示，饮用红酒可以拮抗AD，并且减轻AD病人的认知障碍及Aβ病理作用。进一步的研究证实，白藜芦醇可以拮抗Aβ的毒性作用，并且这种作用是通过直接和间接两种途径发挥。拮抗Aβ毒性的直接作用方式主要有，抑制Aβ的生成、抑制Aβ的纤维化及聚合、改变Aβ的构型、促进Aβ的降解。而间接作用方式包括抗氧化和抗炎症作用。新近的资料显示，白藜芦醇还可以通过激活sirtuins（又称为SIRT，沉默信息调节因子2，属于组蛋白脱乙酰基酶家族）发挥保护作用。因而，近期更多的研究是致力于明确白藜芦醇增强SIRT1活性，继而引发SIRT1对细胞内途径的激活或调节的机制。SIRT1参与体内多种生理功能的调节，在多种生物体模型中具有延长寿命的作用，同时对多种损伤具有保护作用。而且SIRT1在神经系统也发挥重要作用，研究表明SIRT1对维持正常的认知功能及突触的可塑性非常重要。如SIRT1的激活增强了突触的可塑性，而SIRT1功能的丧失，则会对突触的可塑性过程产生损伤。进一步地研究发现SIRT1的这种功能是通过脑内特异的小RNA（micro-RNA）对cAMP反应结合蛋白（CREB）表达的转录后调节实现的，由此可最终产生对突触可塑性，包括长时程增强（LTP）和长时记忆的影响。离体的研究也显示，低剂量的Aβ可以降低神经元激活诱导的CREB的磷酸化。与上述实验研究相对应的临床检测结果是，通过对AD患者大脑的尸检发现p-CREB的水平明显下降。因此Aβ对神经元功能的早期损伤很可能是涉及包括CREB信号系统的改变。最新的报道也显示，AD患者顶叶皮层中的SIRT1含量明显的下降（信使RNA含量下降了29%，蛋白含量下降了45%），而且这种下降与Aβ和τ蛋白在大脑皮层的聚集密切相关。综上所述，现有的证据显示：在AD病理过程中，Aβ的毒性发挥重要作用，包括可能导致SIRT1的表达下调，同时也降低了CREB的磷酸化水平。那么白藜芦醇是否会通过影响Aβ所致的上述病理过程发挥保护作用呢？本研究的科学假设是：白藜芦醇可能通过抑制Aβ所致的SIRT1含量及CREB磷酸化水平的下降，拮抗Aβ造成的学习和记忆功能的损伤，从而发挥神经保护作用。第一部分：白藜芦醇拮抗Aβ_1-42的毒性恢复大鼠学习记忆行为的作用观察1、研究目的Aβ的低聚物及纤维被认为是Aβ毒性作用的关键因素，而Aβ是导致AD一系列病理过程的核心环节，包括Aβ造成的AD患者学习和记忆的损伤。有报导显示，白藜芦醇可以减轻Tg2576小鼠和p25小鼠（两种AD模型小鼠）的空间记忆损伤，也可以减轻经侧脑室注射Aβ25-35的大鼠的空间记忆损伤。为模拟AD的病理过程，我们对大鼠进行双侧海马注射Aβ_1-42，在此基础上注射白藜芦醇，用水迷宫实验来进行学习记忆的行为学检测，观察白藜芦醇对Aβ_1-42产生的对大鼠学习记忆毒性作用的影响。2、材料和方法成年的雄性SD大鼠（体重220-240克），随机分成8组，n=9。处理如下：1.溶剂对照组；2. Aβ_1-42（0.22nM/1μl）组；3. Resveratrol（0.05nM/1μl、0.22nM/1μl、0.44nM/1μl）组；4. Resveratrol（0.05nM/1μl）+Aβ_1-42（0.22nM/1μl）组；5. Resveratrol（0.22nM/1μl）+Aβ_1-42（0.22nM/1μl）组；6. Resveratrol（0.44nM/1μl）+Aβ_1-42（0.22nM/1μl）组。海马注射手术后，第8天进行水迷宫行为检测。3、结果（1）双侧海马注射Aβ_1-42损伤大鼠的学习和记忆功能在5天的学习训练期内，Aβ_1-42处理组大鼠的逃逸潜伏期（从入水至到达并停留在平台的时间）明显地长于溶剂对照组（p<0.05）。在空间探索实验中，平台被撤去，溶剂对照组的大鼠在目标象限（target quadrant，TQ）逗留的时间要多于其他象限。而Aβ_1-42处理组大鼠在TQ逗留的时间要明显地少于溶剂对照组的大鼠的逗留时间（p<0.05）。（2）白藜芦醇单独处理不影响大鼠的学习记忆功能白藜芦醇（0.05nM,0.22nM or0.44nM）单独处理后，在学习训练期内，与溶剂对照组相比，没有观察到其对大鼠的学习记忆功能产生明显的影响（p>0.05）。在空间探索实验中，也没有观察到其在TQ内的逗留时间与溶剂对照组有明显差异（p>0.05）。（3）白藜芦醇预处理抑制了Aβ_1-42所致的大鼠学习记忆行为学的改变在学习训练期内，白藜芦醇（0.05nM，0.22nM）预处理明显地抑制了Aβ_1-42对大鼠逃逸潜伏期的影响（p<0.05），但0.44nM白藜芦醇预处理，却没有观察到这一作用（p>0.05）。在空间探索实验中，与Aβ_1-42处理组的大鼠相比，白藜芦醇（0.05nM，0.22nM）预处理组的大鼠在TQ逗留的时间明显延长（p<0.05）。白藜芦醇预处理各组的大鼠在TQ内逗留的时间与溶剂对照组相比均无明显差异（p>0.05）。（4）白藜芦醇和Aβ_1-42均未影响大鼠的视力和游泳速度在可见平台实验中，各组到达平台的时间没有任何差异（p>0.05）。另外，各组5天内的游泳速度也没有明显差异（p>0.05）。这表明各组的大鼠都没有视力或运动的损伤。4、小结（1）双侧海马注射Aβ_1-42损伤了大鼠的学习记忆的活动；（2）白藜芦醇预处理抑制了Aβ_1-42所致的大鼠学习记忆行为的改变；（3）白藜芦醇预处理抑制Aβ_1-42所致的大鼠学习记忆功能的损伤未表现出明显的浓度依赖性。第二部分：白藜芦醇拮抗Aβ_1-42所致大鼠海马LTP压抑的作用观察1、研究目的研究表明，海马是除皮层外最重要的与学习记忆有关的脑区，在学习记忆中发挥非常重要的作用，而突触传递的长时程增强（LTP）是被公认的学习记忆在细胞水平的模型。研究显示，用合成的Aβ或天然的Aβ急性处理后，会损伤海马的LTP。我们的实验将首先观察，海马注射Aβ_1-42对由高频刺激（HFS）诱导的海马LTP的影响，在此基础上观察白藜芦醇是否会拮抗Aβ_1-42对LTP的压抑作用。2、材料和方法成年的雄性SD大鼠（体重220-240克），随机分成4组，n=6。处理如下：1.溶剂对照组；2. Aβ_1-42（0.22nM/1μl）组；3. Resveratrol（0.22nM/1μl）组；4. Resveratrol（0.22nM/1μl）+Aβ_1-42（0.22nM/1μl）组。3、结果（1）海马注射Aβ_1-42明显抑制了CA1区由HFS诱导的LTP首先，我们确认了海马注射Aβ_1-42明显地抑制了在体HFS诱导的LTP。在海马注射Aβ_1-42（0.22nM）后，我们观察了30分钟内的fEPSPs，及HFS后1小时内的突触反应。我们发现海马注射Aβ_1-42对基础的突触传递没有明显的影响。但是对LTP的诱导有明显的压抑作用（溶剂对照组：149.1±2.08%，Aβ组：121.5±2.73%， p <0.05）。（2）白藜芦醇单独处理未影响基础的突触传递及LTP为了检测白藜芦醇预处理是否会拮抗Aβ_1-42所致的LTP损伤，我们首先观察了白藜芦醇单独作用对基础突触传递及HFS诱导的LTP的影响。与溶剂对照组相比，海马注射白藜芦醇（0.22nM）后，30分钟内的基础突触传递，及HFS诱导的LTP均无明显影响（白藜芦醇组：141.1±2.44%，溶剂对照组：149.1±2.08%，p>0.05）。（3）白藜芦醇预处理抑制了Aβ_1-42所致的LTP损伤随后的实验我们观察了白藜芦醇与Aβ_1-42共同作用对基础突触传递及HFS诱导的LTP的影响。基础的突触传递没有明显改变。但在有白藜芦醇预处理时，可以观察到其对Aβ_1-42所致的LTP损伤的明显的抑制作用（Aβ组：121.5±2.73%，白藜芦醇+Aβ组：137.3±3.42%，p <0.05）。（4）Aβ_1-42和白藜芦醇对双脉冲易化（PPF）均未产生影响各处理组均可记到在体正常的PPF，表明上述各种处理均没有明显影响Schaffer侧支与CA1之间的突触传递及突触前事件。4、小结（1）海马注射Aβ_1-42显著压抑了CA1区HFS诱导的LTP；（2）白藜芦醇预处理显著拮抗了Aβ_1-42所致的LTP压抑。第三部分：白藜芦醇对Aβ_1-42所致大鼠海马SIRT1含量和CREB磷酸化水平下降的作用观察1、研究目的SIRT1对维持正常的认知功能及突触的可塑性非常重要。SIRT1的激活增强了突触的可塑性，而SIRT1功能的丧失，则会对突触的可塑性造成损伤。并且，SIRT1的这种功能是通过脑内特异的小RNA（micro-RNA）-miR-134对cAMP反应结合蛋白（CREB）表达的转录后调节来实现的。最新的报道也显示，AD患者顶叶皮层中的SIRT1含量有明显的下降（信使RNA含量下降了29%，蛋白含量下降了45%），而且这种下降与Aβ在大脑皮层的聚集密切相关。另外，亦有报道表明，在3xTg-AD小鼠（一种广泛使用的AD模型小鼠）的海马内，pCREB比基础水平减少了40%。本部分实验，我们将检测大鼠海马的SIRT1含量及CREB的磷酸化水平。首先观察海马注射Aβ_1-42是否对SIRT1的表达和CREB的磷酸化产生影响，随后观察白藜芦醇对Aβ_1-42所致大鼠海马SIRT1含量和CREB磷酸化水平下降的影响。2、材料和方法在完成第一部分观察的大鼠，即结束水迷宫实验后，经麻醉后断头，其大脑被迅速移至冰台，用冰冷的生理盐水冲洗。将其海马分离，并迅速放入液氮，然后转入-80°C冰箱，备用。用western blotting对目的蛋白进行定量检测。3、结果（1）白藜芦醇对Aβ_1-42所致的大鼠海马SIRT1下降的影响与溶剂对照组相比，Aβ_1-42处理组大鼠海马的SIRT1蛋白水平显著下降，这种下降可被白藜芦醇预处理所逆转。而白藜芦醇单独处理并未产生对海马SIRT1蛋白水平的影响。（2）白藜芦醇对Aβ_1-42所致的大鼠海马CREB磷酸化下降的影响与溶剂对照组相比，Aβ_1-42处理组大鼠海马的CREB磷酸化水平显著下降，这种下降可被白藜芦醇预处理所逆转。而白藜芦醇单独处理并没有明显影响海马的CREB磷酸化水平。4、小结（1）白藜芦醇抑制了Aβ_1-42所致的大鼠海马SIRT1的下降；（2）白藜芦醇抑制了Aβ_1-42所致的大鼠海马CREB磷酸化的下降。结论：1、Aβ_1-42双侧海马注射产生对学习、记忆的抑制，表现为水迷宫行为的改变及海马LTP的压抑；2、白藜芦醇预处理发挥了对Aβ_1-42毒性的保护作用，表现为白藜芦醇取消了Aβ_1-42引起的学习记忆行为（水迷宫）的改变，以及Aβ_1-42引起的海马LTP的压抑；3、白藜芦醇神经保护作用的机制可能与其对SIRT1与CREB的影响有关，表现为白藜芦醇可以取消Aβ_1-42对SIRT1的表达下调的作用，以及白藜芦醇可以取消Aβ_1-42对CREB磷酸化的抑制作用。