近年来,随着人类活动对生态环境影响的深入,环境中的物种多样性逐渐变得复杂且不稳定,如何快速准确的检测出某一生态系统中物种多样性信息成为评估其稳定性、建立生态概念和模型的关键过程。现代科技的高速发展,催生出分子生物学的方法,而今越来越多的研究都离不开分子技术的帮助。环境DNA结合高通量测序来进行多物种种类区分鉴定的方法,是一种快速、高效的调查某一群落里物种丰度的方法,近十年来,人们逐渐开始应用DNA宏条形码技术对各种生态环境中各种生物的生物量的调查。在研究过程中,总结前人经验发现DNA宏条形码技术的应用主要分为以下3对关系:环境中生物与e DNA,环境中e DNA与提取到e DNA,提取到的e DNA量与PCR产物的高通量测序结果。由此可见,复杂的方法性研究可以拆分成这3个部分,对应3个方向:生物DNA与环境的交互规律,e DNA的富集,高通量测序结果的分析。定量研究亦是如此,将它们分别梳理清晰,才是研究好DNA宏条形码技术的光明大道。对DNA宏条形码技术应用于监测渔业生物多样性方法的研究,解决一些例如e DNA富集等方法上的难题,将归纳整理出一套便利且可行的方案,对实践操作提出一定的指导性,有利于推动此方法在资源调查上的应用发展。现阶段主流的过滤操作有:根据滤膜孔径的大小来选用不同的滤膜(0.22μm或0.45μm等),根据过滤方式有单一滤膜过滤及不同孔径滤膜组合分级过滤。本研究通过设计试验,比较分级过滤时,不同孔径滤膜上富集到的e DNA的高通量测序结果,以分析分离过滤对检测结果的影响。结果表明,应用分级过滤的方式更有利于操作,使用大孔径滤膜(20μm)先将水样中较大的组织颗粒去除,可以有效降低最终结果中“比例异常”的reads出现,并且不影响小孔径滤膜(0.22μm)对e DNA的富集效率。在通常实验操作中,因为所使用的仪器设备存在一定误差,人为操作也具有一定的偏差性,所以不可避免地会产生系统误差,因此往往会通过设置平行样品并计算最终结果均值的方式来降低偶然误差的影响,尤其在应用于数量分析时,平行样品的设置是十分必要的,但目前DNA宏条形码技术应用测定结果的重复性检验仍缺乏直接证据,故本研究使用同一养殖水样做为研究对象,用DNA宏条形码技术的方法分别做10次平行检测,结果表明检测结果比较接近,可见重复性稳定,在实验操作中,设置3份平行样已足够分析使用。探究资源量与宏条形码技术检测结果之间的关系,初步探索出应用DNA宏条形码技术检测环境中e DNA含量的方法,是应用此方法监测环境中资源量的关键,虽然大量证据表明e DNA高通量测序获得的reads数与自然环境中生物相对数量具有相关性,但一直不能得出明确的量化关系结果。从环境生物到实验室检测数据,e DNA的富集效率难以评估,同时e DNA扩增过程中不可避免地出现引物偏倚现象,导致了e DNA宏条形码技术的检测结果存在诸多不确定性,从而制约了该技术在生物资源调查领域的推广应用。假定水体中的e DNA全部回收,且PCR扩增时不存在引物偏倚性,这种理想状态下的水体中e DNA组成与其高通量测序reads数是否存在线性关系?为此,本研究在实验室可控条件下,选择凡纳滨对虾和墨吉对虾两个同属近缘种,对其DNA样品进行不同比例混合,模拟从自然水体中富集到的e DNA复合样品,既保证了样品的回收率,又降低了引物偏倚的干扰。以此为模板,探究e DNA宏条形码技术检测种群相对数量的准确性。结果发现当两个物种DNA模板浓度比例为1:1时,高通量测序结果注释得到的两个物种reads数比值为13/24(墨吉对虾/凡纳滨对虾),可见,即使是同属近缘种间依然存在轻微的引物偏倚现象,引物偏移率为1.5%。同时,根据七个试验组获得的高通量测序结果注释得到的两个物种reads数比值与对应模板中两个物种DNA浓度比值之间的线性回归分析表明,水体中e DNA组成与其高通量测序reads数间呈明显线性关系,即y=0.0716x+0.7043(r2=0.9824)。本研究初步探索出高通量测序结果与初始模板底物量的关系,为利用宏条形码技术检测生物量提供了一种新的思路:在用DNA宏条形码技术研究特定环境中物种相对数量时,可以采用分析不同物种间测序结果reads数比值的方式,来进行数量性研究。