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锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV),又称为鲤疱疹病3型(Cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3),能够导致鲤鱼、锦鲤及其变种患上高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)。锦鲤疱疹病毒病是在20世纪末被发现及确认的,现已在全球范围内爆发,严重威胁鲤和锦鲤养殖产业安全。目前,锦鲤疱疹病毒病没有药物可以防控,疫苗是控制疾病最有效的方法。本论文通过研制安全高效低成本的碳纳米管载核酸疫苗,疫苗经肌肉注射、浸泡免疫的方式,在一定剂量范围内能够获得较好的免疫保护效果,有效降低KHVD对锦鲤的致死率,为后续疫苗研发应用奠定基础。全文内容主要分为以下三个部分:1、单壁碳纳米管载锦鲤疱疹病毒ORF149(SWCNTs-ORF149)核酸疫苗的构建:在实验室前期研究基础上,从锦鲤疱疹病毒的候选抗原蛋白中筛选囊膜蛋白ORF149作为本实验的目标蛋白。以单壁碳纳米管(SWCNT)作为运输载体,构建锦鲤疱疹病毒(KHV)ORF149核酸疫苗。首先构建pc DNA3.1(+)-ORF149重组质粒,通过瞬时转染和免疫印迹分析确定其表达情况,最后通过1,3-偶极环加成反应法将重组质粒与SWCNTs进行偶联。结果表明,构建的重组质粒转染细胞后在免疫印迹分析和间接免疫荧光试验中均能检测到特异性信号,而空白对照组均无反应;在核酸琼脂糖凝胶电泳中,构建的重组疫苗电泳痕迹消失;在场发射扫描电镜观察下,与重组质粒进行偶联的SWCNTs和空白SWCNTs形态差异明显。成功构建了单壁碳纳米管载KHV ORF149新型核酸疫苗,为后续进行免疫效果研究奠定基础。2、SWCNTs-ORF149核酸疫苗注射免疫及效果评价:将重组核酸疫苗(SWCNTs-ORF149)通过肌肉注射的方式,分别以1μg、5μg和10μg三个剂量对进行免疫。注射后体内重组质粒表达检测显示,ORF149成功进入鱼体并表达;免疫后1-8周血清效价检测发现,三个实验组血清抗体水平均明显高于空白对照组,其中10μg注射剂量组抗体水平最高,并在第4周时达到峰值;免疫相关基因检测表明,实验组免疫相关基因均出现上调,10μg组上调幅度最大,与血清检测结果一致;免疫相关生理指标检测,如酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性等,结果显示实验组均出现明显升高免疫4周后进行攻毒实验,实验组死亡率低于空白对照组,10μg注射组死亡率最低,其相对免疫保护率达到81.9%,显著高于其他组。说明重组核酸疫苗(SWCNTsORF149)通过肌肉注射免疫的方式,能有效降低KHV的致死率,达到较好的免疫保护效果。3、SWCNTs-ORF149核酸疫苗浸泡免疫及效果评价:将重组核酸疫苗(SWCNTs-ORF149)通过浸泡的方式,分别以1mg/L、5mg/L和10mg/L三个剂量进行免疫。免疫后1-8周血清效价检测发现,10mg/L实验组血清抗体水平均明显高于空白对照组,其中10mg/L剂量组抗体水平最高,并在第4周时达到峰值;免疫相关基因检测表明,10mg/L组上调幅度最大,与血清检测结果一致;免疫相关生理指标检测,如酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性等,结果显示10 mg/L实验组出现明显升高;免疫4周后进行攻毒实验,结果表明实验组死亡率低于空白对照组,10mg/L组死亡率最低,其相对免疫保护率达到56%,显著高于其他组。说明重组核酸疫苗(SWCNTsORF149)通过浸泡免疫的方式,也能有效降低KHV的致死率。本文通过构建单壁碳纳米管偶联的锦鲤疱疹病毒ORF149重组核酸疫苗,研究了在肌肉注射与浸泡两种免疫方式作用下核酸疫苗的免疫效果,为后续疫苗投入实际应用奠定基础。