膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是骨科中最常见的慢性致残性疾病,病变主要特征在于关节软骨的退变。长期以来一直认为KOA的发生归咎于机械性磨损和机体衰老的过程。但最新研究发现潜在的致病机制不仅仅是由于机械应力的增加,而且涉及其分泌的一些脂肪因子所产生的低等级炎症反应。抵抗素,是一种由108个氨基酸肽组成的12 k Da的富含半胱氨酸的多肽激素蛋白,与KOA具有密切相关性。大量研究表明,KOA患者血清及膝关节局部关节液中resisitn浓度明显高于健康对照。特别是局部关节液resisitn浓度,与KOA症状严重程度密切相关。此外,体外人膝关节软骨细胞实验及体内动物实验也都证实,resisitn具有促进软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶进而诱发KOA病理进程的作用。既往的研究显示,resisitn介导的炎症反应是通过结合CAP1受体来发挥下一步的调控作用。而且CAP1也是目前为止被证实在人体抵抗素唯一真正直接结合的受体,但是CAP1在resisitn诱导的KOA病理进程中是否发挥受体作用仍需要去证实。激活p38-MAPK和NF-κB信号通路被证实可以显著促进炎症反应、加速病理进程。但是抵抗素是否通过p38-MAPK和NF-κB信号通路促进软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶进而诱发KOA病理进程的作用尚不清楚。因此,本课题研究主要探索resisitn在诱导KOA病理进程中的调控机制,进一步完善KOA发病机制,为KOA的防治提供新的理论基础。在我们的研究中,首先检测了resisitn在KOA患者及健康对照患者血清和关节液中的表达水平,明确了resisitn在KOA患者中高表达。进一步探索人KOA软骨组织中CAP1的表达改变。在体外软骨细胞实验中验证CAP1是否是resisitn直接结合的受体,同时用腺病毒转染敲除CAP1基因表达,进一步验证CAP1在resisitn诱导软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶中的作用。最后,还在体外软骨细胞实验中探索了p38-MAPK和NF-κB信号通路在resisitn-CAP1中的作用。本研究分为4个部分:1)Resistin在KOA患者及健康对照人群血清和关节液中的表达特点和临床相关性分析;2)CAP1在KOA软骨组织中表达特点及与resistin表达的相关性分析;3)Resistin对KOA软骨细胞刺激效应及CAP1在其中的作用研究;4)p38-MAPK和NF-κB信号通路在Resistin-CAP1调控软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶中的作用研究;第一部分:Resistin在KOA患者及健康对照人群血清和关节液中的表达特点和临床相关性分析目的:了解resistin在KOA患者及健康对照人群血清和关节液中的表达特点,并分析其临床相关性。方法:该研究选取纳入受试对象时间段为2017年5月-2018年6月。在我院骨关节外科纳入103例因KOA行初次膝关节置换的患者,同时在我院健康体检中心纳入86例行常规年度体检无KOA症状人群。收集两组患者及对照人群相关临床资料、血清,及KOA患者的膝关节液。用ELISA法检测两组患者血清、膝关节液中resistin的浓度。比较两组患者人群的临床特征、血液及膝关节液中resistin水平,并分析其与临床特征的相关性特点。结果:(1)与健康对照组(Healthy Control,HC)相比,KOA组患者年龄较大(KOA vs.HC:63.67 vs.51.36,p<0.0001),更大的BMI(KOA vs.HC:26.42 vs.23.47,p<0.0001)及较高的空腹血糖水平(KOA vs.HC:5.54 vs.5.03,p<0.0001).两组患者在性别比例、甘油三酯、高密度脂蛋白水平无明显差别。(2)KOA患者血清中resistin水平高于HC组(KOA vs.HC:8.26 vs.7.45,ng/ml),调整相应年龄、BMI、空腹血糖及甘油三酯后两组间差异消除(padj=0.688)。KOA患者血清resistin水平显著高于其膝关节液水平(Serum vs.SF:8.26 vs.3.26,ng/ml,p<0.0001).(3)KOA患者中,Kellgren-Lawrence(K-L)分期为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者分别为18例、38例和47例。K-L分期Ⅳ期患者血清resistin表达水平显著高于Ⅱ期(K-LⅣvs.Ⅱ:8.97 vs.7.11,ng/ml,p=0.021)。KOA患者中,K-L分期为Ⅳ期患者关节液浓度高于Ⅱ期和Ⅲ期(K-LⅣvs.Ⅱ:3.85 vs.2.60,ng/ml,p<0.0001;K-LⅣvs.Ⅲ:3.85 vs.2.86,ng/ml,p<0.0001)。结论:Resistin在KOA患者中血清中表达增高,而且局部膝关节液中resistin表达水平和KOA严重程度呈正相关性。提示resistin表达水平和KOA具有明显相关性。第二部分:CAP1在KOA软骨组织中表达特点及与resistin表达的相关性分析目的:研究CAP1在KOA患者关节软骨组织中的表达改变情况及其与resistin表达是否有相关性。方法:收集21例KOA患者及10例股骨颈骨折患者关节软骨组织。首先采用RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测两组软骨组织中CAP1的m RNA和蛋白表达情况。然后用免疫组化技术检测两组患者软骨组织中CAP1及resistin蛋白的表达特点。并用ASI digital systems(powered by Gen ASIs?)软件进行两组免疫组化H-Score评分,分析其相关性。结果:纳入21例KOA患者(F/M,15/6)及10例股骨颈骨折患者(F/M,7/3),股骨颈骨折患者年龄较大(KOA vs FNF:63.14 vs 76.40,p<0.0001)。与股骨颈骨折的软骨组织相比,在KOA患者软骨组织中,RT-PCR结果显示CAP1的m RNA表达明显增高(KOA vs.FNF:2.93 vs.1.03,p<0.0001),并且Western blot蛋白印迹显示CAP1蛋白表达也明显增高(KOA vs.FNF:2.46 vs.1.00,p=0.010)。免疫组化H-Score评分结果提示,KOA患者软骨组织中CAP1表达增高(KOA vs FNF:168.90 vs 66.32,p<0.0001)、resistin表达也增高(KOA vs FNF:152.40 vs 67.45,p<0.0001),CAP1与resistin表达具有明显正相关性(r=0.631,p=0.002)。结论:CAP1在KOA患者软骨组织中表达增高,且与resistin表达呈现正相关性。第三部分:Resistin对KOA软骨细胞刺激效应及CAP1在其中的作用研究目的:探索resistin对KOA软骨细胞的刺激效应及CAP1在其中的作用。方法:(1)随机选取9例KOA患者分成3组,取大体正常的软骨组织分离培养出软骨细胞。每组3例患者的软骨细胞混合培养。人软骨细胞分别与人重组resistin蛋白在浓度为0 ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml条件下,分别培养24 h、48 h和72 h。与未加resistin蛋白的软骨细胞对比,用CCK-8实验检测resistin对软骨细胞毒性的影响,同时用RT-PCR检测resistin浓度和培养时间对CAP1表达的影响。(2)分别用人重组resistin蛋白500ng/ml按时间依赖性(24h、48h、72h)共培养刺激人软骨细胞。浓度依赖性来刺激实验中,用人重组resistin蛋白(250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)和人软骨细胞共培养48h。选取未加resistin作为实验对照。用RT-PCR检测resistin刺激后软骨细胞CCL3、CCL4、MMP-13、ADAMTS-4及表达情况。(3)用人重组resistin蛋白(500ng/ml)与KOA软骨细胞共培养刺激48 h,利用免疫共沉淀技术分析在人软骨细胞中CAP1蛋白是否与resistin直接结合。(4)用腺病毒转染技术定向敲除软骨细胞中CAP1的表达。软骨细胞转染腺病毒后分为阴性对照组(Control-sh RNA1)和阳性CAP1敲除组(CAP1-sh RNA)。用RT-PCR和Western blot技术检验敲除效果。用resistin蛋白(500ng/ml)分别与两组软骨细胞共培养48h和72h。用RT-PCR检测CCL3、CCL4、MMP-13、ADAMTS-4的m RNA表达情况,用ELISA来检测软骨细胞上清液中CCL3、CCL4、MMP-13、ADAMTS-4的蛋白分泌情况。结果:(1)CCK-8实验结果表明,与未加resistin的对照组相比,24 h内任何浓度的resistin刺激未见显著的软骨细胞生长抑制;只有浓度为1000 ng/ml的resistin在刺激48 h和72 h才会对软骨细胞的生长产生显著抑制效果(48 h:p<0.01;72 h:p<0.001)。软骨细胞中CAP1表达只有在resistin浓度为1000 ng/ml刺激48小时(p<0.01)和72小时(p<0.01)才会显著升高。(2)KOA软骨细胞resistin刺激后,时间依赖性结果表明:CCL3和MMP-13的m RNA表达水平随着时间逐渐增高,在48h达到峰值之后表达下降;CCL4和ADAMTS-4的m RNA表达增高且在24h立刻达到峰值,随即逐渐下降。Resistin刺激后浓度依赖性结果表明:CCL3的m RNA表达随着浓度增加逐渐增高,但是在浓度大于500ng/ml之后增加缓慢;CCL4和ADAMTS-4的m RNA表达水平随着resistin浓度增加而增加;MMP-13的m RNA表达在500ng/ml达到峰值,随后表达下降。(3)免疫共沉淀结果提示在软骨细胞中CAP1可以与外源性resistin直接结合而发挥受体作用。(4)腺病毒转染CAP1基因敲除后,RT-PCR和Western blot显示CAP1在软骨细胞中敲除效果大于90%。与Control-sh RNA组软骨细胞相比,CAP1-sh RNA组软骨细胞在人重组resistin蛋白刺激48h和72h后:RT-PCR显示软骨细胞CCL3、CCL4、MMP-13和ADAMTS-4的m RNA在48h和72h的表达明显降低;ELISA结果提示软骨细胞上清液中CCL4蛋白在48h和MMP-13蛋白在72h表达也明显降低。结论:高浓度的resistin可对软骨细胞产生细胞毒性抑制其生长。Resistin刺激KOA软骨细胞上调CCL3、CCL4、MMP-13和ADAMTS-4的表达而起到促炎症反应和促基质分解作用,CAP1作为与resistin直接结合的受体在其中起到关键作用。在软骨细胞中基因敲除CAP1的表达可显著降低resistin诱导的CCL3、CCL4、MMP-13和ADAMTS-4的表达。第四部分:p38-MAPK和NF-κB信号通路在resistin-CAP1调控软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶中的作用研究目的:探索p38-MAPK和NF-κB信号通路在resistin-CAP1调控KOA软骨细胞参与的炎症反应和基质降解中的作用。方法:取KOA软骨细胞培养,先分为五组:加resistin(500ng/ml)后30分钟组、60分钟组、6小时组、24小时组及未加resistin的空白对照组。在按CAP1是否敲除及是否加入resistin(500ng/ml)分四组:CAP1-sh RNA组、CAP1-sh RNA加resistin组、Control-sh RNA组、Control-sh RNA加resistin组。用Western blot技术检测p-38蛋白、磷酸化-p-38蛋白(phospho-p38)、p-65蛋白和磷酸化-p-65蛋白(phospho-p65)表达情况,来分析p38-MAPK和NF-κB信号通路在KOA软骨细胞resistin刺激后及CAP1在其中的作用。结果:Western blot结果显示,p38和p65在resistin刺激后未见明显变化,phospho-p38水平在resistin刺激后6h时升高并在24h时达到峰值,phospho-p65水平在resistin刺激后60分钟达到峰值之后略有下降。与Control-sh RNA组比较,CAP1敲除的CAP1-sh RNA组,phospho-p38和phospho-p65蛋白表达水平显著降低,p38和p65蛋白表达水平也轻度降低。结论:Resistin-CAP1通过激活p38-MAPK和NF-κB信号通路调控软骨细胞参与KOA炎症反应和基质降解进程。