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研究背景食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一,病理分型为鳞癌和腺癌,常以鳞癌多见,约占90%以上。恶性肿瘤的癌变是经历一系列复杂过程的,是一种多元化的机体反应,其发生发展的过程可能涉及到一系列凋亡通路的激活及抗凋亡通路的失活。食管粘膜发生的癌变也是如此。目前随着外科治疗、放疗和系统化疗的日趋完善,早期食管癌的疗效取得了很大的提高,但中晚期患者的预后较差,5年生存率不足20%,严重危害人民的生命和健康。目前,利用分子生物学技术,从基因水平上探索肿瘤的发生、发展及治疗已成为当代研究的热点。BIT1基因是研究整合素对Bcl-2的表达调控时发现的一个新基因,因其具有下调Bcl-2表达的功能而命名为BIT11(Bcl-2inhiBIT1or of transcription1)。后续试验也证实了,BIT1从最低等的生物到高等动物的人类都具有相对保守的序列。BIT1的表达量在人体内各器官的表达不尽相同,比如在睾丸、骨骼肌及肝脏表达量相对高,而在胸腺及外周血白细胞中表达量非常低,几乎检测不到。有研究认为BIT1蛋白在生理状态下定位于线粒体膜间隙,当BIT1蛋白释放到胞浆或者在胞浆中表达BIT1时,则与AES(amino-terminal enhancer of split)相结合,诱导细胞脱粘附,促进细胞的失离巢凋亡,此过程中BIT1起着促进细胞凋亡的作用,到目前为止,BIT1正常的作用还不太明确。但有最新研究表明BIT1蛋白定位于高尔基体,BIT1蛋白具有抑制细胞凋亡作用。关于BIT1与恶性肿瘤的关系,实验研究及文献均较少,纵观各个研究结果,差异对比比较大。而BIT1在食管恶性肿瘤(食管鳞癌最常见)的研究,鲜有报道。因此,研究BIT1线粒体蛋白对于探索凋亡的发生和调节具有重要意义。目的本研究先用BIT1siRNA转染EC9706食管鳞癌细胞,阻断BIT1的表达,用蛋白印迹法检测食管鳞癌EC9706细胞中BIT1蛋白干扰前后的表达情况,用MTT法、划痕实验法分别检测BIT1干扰前后EC9706细胞的增殖活力情况及划痕愈合情况,分析BIT1与食管癌的关系,探讨其在食管癌发生发展及侵袭转移中的作用及临床意义。方法1.瞬时转染：先用事先合成好的BIT1siRNA质粒载体与lipo2000脂质体混合,导入食管鳞癌EC9706细胞株中,完成BIT1的瞬时转染；2.蛋白印迹法：BIT1siRNA沉默EC9706食管鳞癌细胞株中BIT1,分别于24h,48h,72h,96h,120h,144h,168h时提取EC9706细胞蛋白,采用蛋白印迹方法检测干扰前后BIT1蛋白表达含量的变化；3.四甲基偶氮唑蓝法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别于24h,48h,72h,96h,120h,144h,168h检测转染前后EC9706细胞增殖能力的变化；4.划痕实验法：对EC9706食管鳞癌细胞行siRNA转染后24h后,采用划痕实验方法检测0h,12h,24h,36h时细胞迁移距离的变化；5.统计学处理：应用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。两样本均数的比较采用t检验；各组之间比较均数用单因素方差分析检验；水准a=0.05。结果1Western blot检测干扰效果未转染组,阴性对照组以及瞬时转染后BIT1各表达情况(如图2)。未转染组,阴性对照组,siRNA24h,48h,72h,96h,120h,144h,168h各灰度值依次为：1.49±0.46；1.44±0.53；0.85±0.27；0.53±0.06；0.49±0.05；0.77±0.19；1.12±0.08；1.43±0.30；1.46±0.39；SPSS统计分析示：在siRNA后24h到120h间,转染组与阴性对照组及未转染组相比,统计学有意义(P＜0.05),转染阴性对照组中BIT1的表达与未转染的细胞无明显差异(P＞0.05)。siRNA24h开始BIT1蛋白表达显著减少(P＜0.05),尤以72h干扰效率最高,其干扰效果能持续120h,第144h和第168h BIT1蛋白的表达与阴性对照组无明显差异(P＞0.05)。2MTT法检测细胞增殖的变化根据24h,48h,72h,96h,120h,144h,168h时A值绘制的生长趋势图(如图4)。提示：siRNA组A值明显低于阴性对照组和未转染组(P＜0.05),约于72h时抑制效果最明显,其生长抑制率为：45.9%。从120h起,细胞增殖抑制效果逐渐开始减弱,至第168h时质粒转染组扔对照组无统计学无差异(P＞0.05)。3划痕实验三组EC9706细胞划痕实验结果图(如图5)。从图可以看出：从0h到36h期间,未转染组及阴性对照组划痕可见明显愈合,而转染质粒组其划痕未见明显愈合,SPSS统计分析示：未转染组及阴性对照组对比无统计学意义(P＞0.05),而转染质粒组与阴性对照组及未转染组相比有统计学意义(P＜0.05)。结论1.BIT1在食管鳞癌细胞中可能起着抗凋亡的作用。2.BIT1siRNA能有效沉默BIT1基因,BIT1蛋白的表达与瞬时转染的时间密切相关。3.BIT1有望成为监测肿瘤侵袭转移的可靠指标,阻断BIT1的表达成为未来食管癌的治疗的新靶点。