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背景与目的 食管癌的发病率排名全球恶性肿瘤第七位,死亡率排名第六位。每年全球食管癌新增病例将近一半来自于我国,是我国癌症死亡的五大主要原因之一。目前,食管癌以手术治疗为主,结合放疗、化疗等多学科综合治疗,但其预后不佳,而且放疗、化疗还可能破坏自身免疫系统,从而诱导免疫耐受。因此,探究对机体损伤小且高效的食管癌治疗手段具有极为深远的临床意义。目前研究发现,食管癌的发生发展及预后与树突状细胞密切相关,肿瘤患者体内的树突状细胞由于肿瘤微环境的影响,其数量缺乏,且大部分功能异常,从而严重影响了自身抗肿瘤免疫功能,肿瘤微环境中存在多种免疫抑制因子,其中IL-10的免疫抑制作用最强。因此,近年来有关肿瘤免疫治疗的研究主要集中在寻找并优化抗肿瘤疫苗,以及逆转机体的免疫抑制状态,克服免疫抑制因子对疫苗的抑制作用。本研究应用小干扰RNA抑制IL-10受体表达的树突状细胞进行动物体内实验,首先,应用荧光染料CFSE标记DCs,观察其在局部淋巴结的迁移能力;然后,应用TUNEL染色技术、流式细胞术等方法检测注射不同瘤苗后肿瘤细胞原位凋亡情况;最后,比较皮下、淋巴内以及静脉注射三种不同途径回输DCs瘤苗对移植瘤细胞凋亡情况的影响,以及疗效差异。初步研究IL-10R-si RNA DCs抗食管癌免疫反应的作用和机制,为临床提高DCs瘤苗的治疗效果提供实验基础和理论依据,为肿瘤免疫疫苗临床回输方式提供新的思路。总之,本研究以树突状细胞表面IL-10受体作为研究靶点,主要运用荧光标记示踪、TUNEL染色、流式细胞术及si RNA基因沉默技术研究IL-10R-si RNA DCs抗食管癌免疫反应中的作用和机制,共分为3部分。第一部分:IL-10R-si RNA DCs在局部淋巴结内的迁移能力的研究方法 1.采用人食管癌细胞TE-11接种于裸鼠右侧腋窝皮下,进行裸鼠移植瘤模型构建,并随机分为2组;2.采用荧光示踪法分别向2组小鼠足垫注射等量的CFSE标记的IL-10R-si RNA DCs及普通的DCs,观察DCs在动物体内区域淋巴结迁移的能力。结果 1.应用TE-11细胞(人食管癌细胞)接种于裸鼠皮下,可成功制备移植瘤模型;2.IL-10R-si RNA DCs在腋窝部引流区淋巴结中聚集增多,其迁移能力明显增强。第二部分:IL-10R-si RNA DCs对小鼠体内移植瘤抑制作用的研究方法 1.采用TUNEL染色技术检测注射不同瘤苗后肿瘤细胞原位凋亡情况;2.采用流式细胞技术和Expo 32 ADCs软件分析移植瘤凋亡率;3.采用Multicycle AV软件拟合分析移植瘤细胞凋亡过程中DNA周期变化;4.采用流式细胞技术检测移植瘤组织中凋亡相关蛋白Fas和Caspase-3表达情况。结果 1.IL-10R-si RNA DCs可以显著降低肿瘤细胞增殖指数,提高肿瘤细胞凋亡率;2.IL-10R-si RNA DCs可使移植瘤细胞S、M期降低,抑制移植瘤细胞的有丝分裂,增加肿瘤细胞原位凋亡;3.IL-10R-si RNA DCs可以显著提高Fas和Caspase-3蛋白表达,促进肿瘤细胞凋亡;4.IL-10R-si RNA DCs在体内对食管癌具有强大的细胞毒性作用。第三部分:IL-10R-si RNA DCs最佳回输方式的研究方法 采用皮下、淋巴内以及静脉注射三种途径回输IL-10R-si RNA DCs,比较三种回输方式对疫苗发挥抗肿瘤免疫反应的影响,以及疗效差异。结果 1.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显著缩小移植瘤体积和重量,明显提高肿瘤抑制率;2.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显著降低移植瘤细胞增殖指数,明显提高细胞凋亡率;3.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显著增加肿瘤凋亡相关的蛋白Fas和Caspase-3的表达,促进细胞原位凋亡;4.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显著降低移植瘤细胞DNA周期中S、M期,移植瘤细胞有丝分裂明显受抑制;5.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可以更好的发挥疫苗抗肿瘤免疫反应。结论 1.IL-10R-si RNA DCs解除了IL-10对DCs的抑制作用,增强了迁移能力,为DCs有效发挥抗肿瘤免疫反应创造了有利的前提条件;2.IL-10R-si RNA DCs通过阻断IL-10抑制途径,提高了DCs抗肿瘤免疫反应,促进肿瘤细胞凋亡,为临床提高DCs瘤苗的治疗效果提供实验基础和理论依据;3.淋巴内途径回输IL-10R-si RNA DCs可有效保护DCs免于破坏,进而产生更强的抗肿瘤免疫作用,为肿瘤免疫疫苗临床回输方式提供新的思路。