卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。近期,赫捷院士团队发布了覆盖3.8亿人口的中国最新癌症数据,该研究显示,2016年中国卵巢癌新发病例数57200例,死亡病例数27200例。美国癌症协会（American Cancer Society,ACS）的最新统计数据显示,2021年美国卵巢癌新发病例数21410例,死亡病例数13770例。死亡率在女性肿瘤患者中居于第五位。在全球范围内,卵巢癌患者五年生存率一般介于30%至50%之间。早期卵巢癌临床症状缺乏特异性,且早期卵巢癌的高准确度分子诊断方法有限,因此,超过80%的上皮性卵巢癌患者被确诊时已是临床晚期。浆液性卵巢癌是卵巢癌最常见的组织学类型,恶性程度较高。目前,卵巢癌的一线治疗方案是肿瘤细胞减灭术联合系统性化疗,但多数晚期患者在达到完全缓解后,仍会出现复发和化疗耐药。随着分子医学的发展,抗血管生成药物治疗、聚ADP核糖聚合酶抑制剂（poly ADP-ribose polymerase inhibitor,PARPi）靶向治疗、免疫治疗等新疗法的应用改变了卵巢癌的传统治疗模式。尽管卵巢癌的诊疗技术已取得长足进步,仍有部分患者在短时间内复发。因此,对卵巢癌的分子表达模式和发病机制进行更深入的探索,仍具有十分重要的临床意义。RNA剪接是一种广泛存在于真核生物中的基因调控机制,是剪接体在剪接因子的配合下去除前体信使RNA（precursor messenger RNA,pre-mRNA）的内含子,连接外显子,形成成熟mRNA的过程。剪接因子参与RNA代谢相关的各个生物学过程,包括转录、RNA剪接及RNA降解等。剪接因子的异常表达,与多种肿瘤的恶性进展和免疫失调相关。剪接因子DDX23是DEAD-box RNA解旋酶家族成员,参与U4/U6-U5三聚复合体的组成,是剪接体B复合物形成的必要条件。DDX23在剪接体的组装和RNA剪接过程中发挥至关重要的作用。人体DDX23的错义突变会引起神经系统发育异常。DDX23异常表达与脑胶质瘤和肝细胞癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关。目前,剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌中的系统性研究尚缺乏。DDX23在浆液性卵巢癌中的表达模式尚不清楚,DDX23的表达与浆液性卵巢癌患者的临床预后相关性尚不明确,DDX23对浆液性卵巢癌恶性生物学行为的影响以及相关调节机制尚未阐明。因此,针对以上科学问题,我们对DDX23在浆液性卵巢癌中的临床意义、生物学功能和相关调节机制进行了系统性研究,主要研究内容分为三个部分。第一部分剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌中的表达和临床意义研究目的DEAD-box解旋酶家族是剪接因子的重要成员,本部分旨在利用公共数据库数据,结合本课题组既往研究成果,研究DEAD-box解旋酶家族成员DDX23在浆液性卵巢癌中的表达情况。结合患者临床资料,明确DDX23表达量与患者临床病理特征的相关性以及对患者生存预后的影响。研究方法以本课题组浆液性卵巢癌转录组测序数据和既往研究成果为基础,结合GeneCards数据库数据、CPTAC蛋白质组学数据和TCGA数据,筛选出在浆液性卵巢癌中可能发挥重要作用的剪接因子DDX23,分析DDX23在浆液性卵巢癌中的表达情况。通过qRT-PCR检测浆液性卵巢癌组织和正常输卵管伞组织中DDX23的mRNA表达差异。对组织芯片行免疫组化染色,检测DDX23在浆液性卵巢癌中的蛋白表达情况。结合临床资料,分析DDX23的表达与浆液性卵巢癌患者的年龄、有无腹水、CA125水平等临床病理特征的相关性,并应用Kaplan-Meier法分析DDX23对患者总生存期（Overall survival,OS）的影响。通过Kaplan-Meier plotter在线分析DDX23对卵巢癌患者生存预后的影响。研究结果1.DDX23在浆液性卵巢癌中高表达浆液性卵巢癌中存在RNA剪接相关通路的异常激活。DDX23是浆液性卵巢癌中明显高表达的核心剪接因子之一。CPTAC数据显示,DDX23蛋白在多种肿瘤中高表达,与正常卵巢组织相比,DDX23在卵巢癌中的蛋白表达水平明显升高。TCGA数据和qRT-PCR实验显示,与正常卵巢或输卵管组织相比,DDX23在浆液性卵巢癌中的mRNA表达水平明显升高。2.DDX23表达与浆液性卵巢癌患者临床病理特征的相关性组织芯片免疫组化染色分析显示,与正常输卵管伞组织相比,浆液性卵巢癌标本中DDX23表达显著升高。临床病理特征相关性分析显示,DDX23的表达与患者OS具有相关性,与患者的年龄、有无腹水、CA125水平等因素无关。单因素和多因素Cox回归分析显示,DDX23高表达和晚期FIGO分期是OS的独立危险因素。3.DDX23高表达与浆液性卵巢癌患者不良预后相关根据组织芯片免疫组化染色评分和对应的临床资料,Kaplan-Meier法预后分析显示,与DDX23低表达组患者相比,DDX23高表达组患者的OS更短。Kaplan-Meier plotter网站的在线数据分析结果与本研究一致。研究结论RNA剪接相关通路在浆液性卵巢癌中异常激活。DDX23在浆液性卵巢癌中明显上调。DDX23的表达与浆液性卵巢癌患者的OS具有相关性,DDX23的高表达提示患者预后不良。DDX23有望成为指示浆液性卵巢癌患者预后的有效指标。第二部分剪接因子DDX23对浆液性卵巢癌恶性生物学行为的影响研究目的构建稳定敲低或过表达DDX23的卵巢癌细胞系,探讨剪接因子DDX23对卵巢癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力,以及体内成瘤能力的影响。研究方法通过构建DDX23干扰和过表达质粒,产生对应的慢病毒颗粒并感染卵巢癌细胞,构建稳定敲低和过表达DDX23的卵巢癌细胞系,qRT-PCT和Western Blot实验验证干扰和过表达效率后进行后续实验。MTT细胞增殖实验和平板克隆形成实验,检测DDX23对卵巢癌细胞体外增殖能力的影响。通过流式细胞术检测DDX23对卵巢癌细胞周期进展的影响,通过Western Blot实验检测细胞周期蛋白的表达变化。通过Transwell实验及细胞划痕实验,检测DDX23对卵巢癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响,通过Western Blot实验检测细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）通路蛋白的表达变化。通过裸鼠成瘤实验,探索DDX23对卵巢癌细胞皮下成瘤能力的影响。免疫组化染色实验检测瘤体内细胞增殖相关指标Ki-67的差异表达。通过腹腔成瘤实验,验证DDX23对卵巢癌细胞腹腔种植和播散能力的影响。研究结果1.DDX23促进卵巢癌细胞的体外增殖能力本研究成功构建了稳定敲低和过表达DDX23的卵巢癌细胞系。MTT细胞增殖实验显示,与对照组相比,敲低DDX23明显抑制卵巢癌细胞增殖,抑制效应从第二天开始逐渐增大,在最后一天最为明显;过表达DDX23可以促进卵巢癌细胞增殖。在平板克隆形成实验中,敲低DDX23的卵巢癌细胞产生的细胞克隆较小,数量减少,细胞克隆形成能力明显减弱;过表达DDX23的卵巢癌细胞产生的细胞克隆较大,数量增多,细胞克隆形成能力显著增强。2.DDX23维持卵巢癌细胞周期进展细胞周期分析显示,在卵巢癌细胞中敲低DDX23,G1期细胞的比例升高,S期细胞的比例下降,细胞发生G1期阻滞。通过Western Blot检测细胞周期调节蛋白的表达,结果显示,敲低DDX23使CCND1和CDK4的表达量降低,p21的表达量升高。3.DDX23促进卵巢癌细胞的体外迁移和侵袭能力Transwell实验显示,敲低DDX23使卵巢癌细胞穿过Transwell基底膜的数量明显减少,细胞的迁移和侵袭能力减弱;过表达DDX23使卵巢癌细胞穿过Transwell基底膜的数量明显增多,细胞的迁移和侵袭能力增强。细胞划痕实验显示,敲低DDX23可以明显减缓细胞划痕的愈合速度。通过Western Blot检测EMT通路蛋白表达,结果显示,敲低DDX23使Slug和N-cadherin的表达量降低,E-cadherin的表达量升高。4.DDX23促进卵巢癌细胞的体内成瘤能力在皮下成瘤实验中,DDX23敲低组裸鼠形成的移植瘤明显小于对照组,敲低DDX23可以抑制皮下移植瘤的生长。DDX23敲低组的瘤体内,细胞增殖相关指标Ki-67的表达下降。在腹腔成瘤实验中,DDX23敲低组小鼠形成的腹腔种植瘤明显少于对照组,敲低DDX23可以抑制卵巢癌细胞的腹腔种植和播散能力。研究结论DDX23促进卵巢癌细胞的增殖能力。DDX23是维持卵巢癌细胞周期进展的必要条件,DDX23功能下降使卵巢癌细胞发生G1期阻滞。DDX23促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。DDX23促进卵巢癌细胞的体内成瘤能力,DDX23功能下降使卵巢癌细胞体内成瘤能力减弱。第三部分剪接因子DDX23促进浆液性卵巢癌恶性进展的机制研究研究目的探索DDX23在浆液性卵巢癌中高表达的上游转录调控机制。筛选DDX23功能相关的下游差异表达关键基因,寻找DDX23诱导浆液性卵巢癌恶性表型的下游关键执行者,探索DDX23促进浆液性卵巢癌恶性进展的分子调控机制。研究方法应用TCGA卵巢癌数据进行DDX23基因共表达分析,筛选出Spearman相关系数≥0.35的基因,明确其在卵巢癌和对照组织间的表达量差异。应用Cistrome Data Browser和JASPAR网站,预测DDX23的上游转录因子及两者间的潜在结合位点。最终筛选出既与DDX23表达有相关性,又与DDX23启动子有潜在结合位点的转录因子E2F1。qRT-PCR和Western Blot实验检测E2F1对DDX23的mRNA和蛋白表达的影响。根据JASPAR网站预测的E2F1结合位点序列,使用pGL4.26质粒构建野生型和突变型DDX23报告基因质粒。通过双荧光素酶报告基因实验,明确E2F1对DDX23的转录调控作用。应用染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测E2F1与DDX23启动子区域是否直接结合。应用 DDX23 小干扰 RNA（Small interference RNA,siRNA）和对照 siRNA 瞬时转染A2780细胞,提取细胞总mRNA进行高通量转录组测序（RNA Sequencing,RNA-seq）。筛选DDX23下游差异表达基因并进行生物信息学分析。应用基因共表达分析、TCGA分子差异表达分析和RNA-seq生信分析结果,筛选DDX23的下游关键基因。通过qRT-PCR实验检测下游关键基因在A2780细胞中的表达并确认RNA-seq数据的可靠性。最终筛选出DDX23的下游关键基因FOXM1进行后续研究。应用TCGA和CPTAC数据分析FOXM1在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达差异。利用qRT-PCR和Western Blot在卵巢癌细胞中检测DDX23对FOXM1表达的调控作用。细胞功能实验明确FOXM1对卵巢癌恶性生物学行为的影响。分析FOXM1 mRNA的加工成熟特点,设计合成各转录本特异性引物,通过qRT-PCR实验检测DDX23对FOXM1主要转录本表达的影响,明确DDX23诱导卵巢癌恶性表型的下游分子机制。在敲低DDX23的卵巢癌细胞中过表达FOXM1,进行拯救实验。MTT细胞增殖实验检测FOXM1对敲低DDX23引起的卵巢癌细胞增殖能力下降的拯救作用。Transwell细胞迁移实验检测FOXM1对敲低DDX23引起的卵巢癌细胞迁移能力下降的拯救作用。皮下成瘤实验检测FOXM1对敲低DDX23引起的卵巢癌细胞体内成瘤能力下降的拯救作用。研究结果1.E2F1直接转录激活DDX23的表达对DDX23基因共表达数据、TCGA分子差异表达数据和Cistrome Data Browser、JASPAR网站在线数据进行联合分析,筛选出DDX23潜在的上游转录因子E2F1。基因共表达分析显示,在卵巢癌中,E2F1和DDX23的表达呈正相关。TCGA数据显示,E2F1在卵巢癌中的表达明显上调。qRT-PCR和Western Blot实验显示,在卵巢癌细胞中敲低E2F1,DDX23的mRNA和蛋白表达明显下降,过表达E2F1,DDX23的mRNA和蛋白表达升高;敲低DDX23对E2F1的mRNA和蛋白表达无影响。Cistrome Data Browser 的 ChIP-seq 数据显示,在 HELA、MCF-7、U2OS 和 K652细胞系中,E2F1在DDX23启动子区域存在结合峰。通过JASPAR预测E2F1与DDX23启动子区域潜在的结合位点序列,使用pGL4.26质粒构建野生型和突变型DDX23报告基因质粒。双荧光素酶报告基因实验证明,E2F1可以增强转染野生型DDX23报告基因质粒细胞的荧光活性,但对转染突变型DDX23报告基因质粒细胞的荧光活性无影响。应用A2780细胞进行E2F1的ChIP实验,ChIP-PCR结果显示,E2F1可以直接与DDX23启动子区域相结合。2.DDX23功能相关下游关键差异表达基因的筛选在卵巢癌细胞中敲低DDX23,RNA-seq共识别出4115个差异表达基因（1.5FC,P＜0.05）。其中包含1921个表达上调基因和2194个表达下调基因。GO显示,差异表达基因富集在mRNA的加工过程。联合分析RNA-seq数据、DDX23基因共表达数据、TCGA分子差异表达数据,筛选出17个候选下游基因。qRT-PCR验证17个基因的表达,在A2780中敲低DDX23,17个基因均表达下降。Cistrome cancer的ChIP-seq数据显示,在与DDX23表达相关性最高的5个基因ESPL1、KIF14、TUBG1、KIF11、FOXM1中,ESPL1、KIF14、TUBG1、KIF11被预测为FOXM1的下游靶基因,调控潜能得分分别是 0.943365、0.96575、0.644621、0.988351。DDX23 表达与 FOXM1 呈正相关。TCGA卵巢癌整合基因组分析报告显示,约87%的卵巢癌病例中存在FOXM1分子网络改变,FOXM1作为重要的转录因子,调控众多关键的增殖相关靶基因。TCGA数据显示FOXM1在多种肿瘤中高表达。TCGA和CPTAC的数据显示,在卵巢癌中,FOXM1在mRNA和蛋白水平的表达均上调。结合RNA-seq数据和在线公共数据,我们筛选出FOXM1作为DDX23的下游基因进行后续研究。3.DDX23调控FOXM1主要致癌转录本的表达qRT-PCR和Western Blot实验显示,在卵巢癌细胞中敲低DDX23,FOXM1在mRNA水平和蛋白水平的表达量均明显下降,过表达DDX23,FOXM1表达上调。细胞增殖和迁移实验证明,敲低FOXM1可以抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力,而过表达FOXM1可以促进卵巢癌细胞的增殖和迁移能力。FOXM1有三个主要的转录本,分别是FOXM1A、FOXM1B 和 FOXM1C。FOXM1B和FOXM1C是主要的致癌转录本,FOXM1A没有致癌活性。qRT-PCR实验显示,FOXM1C在卵巢癌细胞中的表达量远高于FOXM1A和FOXM1B。敲低DDX23,FOXM1C的表达量明显下降,而FOXM1A和FOXM1B表达量无明显变化。4.过表达FOXM1拯救因敲低DDX23引起的卵巢癌细胞恶性潜能的下降细胞增殖实验和Transwell细胞迁移实验证明过表达FOXM1可以拯救因敲低DDX23引起的卵巢癌细胞增殖和迁移能力的下降。皮下成瘤实验证明,过表达FOXM1可以拯救因敲低DDX23引起的卵巢癌细胞体内成瘤能力的下降。研究结论在浆液性卵巢癌中,DDX23是E2F1的直接转录激活靶点。E2F1直接结合DDX23启动子区域,转录激活DDX23的表达。DDX23可以调控FOXM1的主要致癌转录本FOXM1C的生成。FOXM1是DDX23诱导浆液性卵巢癌恶性表型的下游关键执行者。结论卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。浆液性卵巢癌是卵巢癌最常见的组织学类型,恶性程度较高。早期卵巢癌临床症状缺乏特异性,且早期卵巢癌的高准确度分子诊断方法有限,因此,多数患者初诊时已是临床晚期。尽管卵巢癌诊疗技术已取得长足进步,仍有部分患者在短时间内复发。RNA剪接是一种广泛存在于真核生物中的基因调控机制。剪接因子的异常表达,与多种肿瘤的恶性进展和免疫失调相关。本课题组既往研究发现浆液性卵巢癌中存在RNA剪接相关通路的异常激活。DDX23是DEAD-box RNA解旋酶家族成员,参与U4/U6-U5三聚复合体的组成,是剪接体B复合物形成的必要条件,在剪接体的组装和RNA剪接过程中发挥至关重要的作用。人体DDX23的错义突变会引起神经系统发育异常。DDX23异常表达与脑胶质瘤和肝细胞癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关。目前,剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌中的系统性研究尚缺乏。DDX23在浆液性卵巢癌中的表达模式尚不清楚,DDX23的表达与浆液性卵巢癌患者的临床预后相关性尚不明确,DDX23对浆液性卵巢癌恶性生物学行为的影响以及相关调节机制尚未阐明。因此,针对以上科学问题,我们对DDX23在浆液性卵巢癌中的临床意义、生物学功能和相关调节机制进行了系统性研究,主要研宂内容分为三个部分。第一部分,将剪接相关通路在浆液性卵巢癌中的异常激活作为研究出发点,应用CPTAC、TCGA等公共数据库数据,结合本课题组既往研究成果,筛选出在浆液性卵巢癌中可能发挥重要功能的DEAD-box RNA解旋酶家族成员DDX23。利用本课题组浆液性卵巢癌组织芯片和相应临床资料,首次系统性地研究了剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌患者中的表达情况和临床病理特征相关性,明确DDX23的表达对患者生存预后的影响。第二部分,本研究通过一系列体内外功能学实验,探讨了DDX23对卵巢癌细胞增殖、迀移和侵袭能力,以及体内成瘤能力的影响。第三部分,一方面,我们对DDX23在卵巢癌中高表达的上游转录调控机制进行了研究。另一方面,我们通过RNA-seq结合生物信息学分析,识别并筛选DDX23功能相关的下游关键差异表达基因,寻找DDX23诱导浆液性卵巢癌恶性表型的下游关键执行者,探索DDX23促进浆液性卵巢癌恶性进展的分子调控机制。最终我们得出以下研究结论:（1） RNA剪接通路在浆液性卵巢癌中异常激活,剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌中呈现高表达状态,与患者总生存期缩短相关,提示患者预后不良。（2） DDX23促进卵巢癌增殖和侵袭等恶性生物学行为,在浆液性卵巢癌中发挥促癌作用。（3）在浆液性卵巢癌中,DDX23是E2F1的直接转录激活靶点。E2F1直接结合DDX23启动子区域,转录激活DDX23的表达。（4） DDX23调控F0XM1主要致癌转录本FOXM1C的表达。F0XM1是DDX23诱导浆液性卵巢癌恶性表型的下游关键执行者。在浆液性卵巢癌中,E2F1直接转录激活DDX23的表达,使DDX23的表达上调。DDX23通过参与mRNA的剪接加工过程,促进致癌基因FOXM1的主要致癌转录本FOXM1C的生成。FOXM1是DDX23诱导浆液性卵巢癌恶性表型的下游关键执行者。本研究的创新性1.本课题以RNA剪接通路在浆液性卵巢癌中的异常激活为出发点,筛选出在浆液性卵巢癌中显著上调的核心剪接因子DDX23。本研究应用组织芯片技术和相应临床资料,首次系统性地研究了DDX23在浆液性卵巢癌患者中的表达情况和临床意义。本研究证明了DDX23的高表达与患者不良预后相关,DDX23有望成为指示衆液性卵巢癌患者预后的有效指标。2.本研究首次明确了剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌中的促癌作用,DDX23是维持菜液性卵巢癌恶性表型的必要条件。3.本研究首次明确了剪接因子DDX23在浆液性卵巢癌中上调的上游转录调控机制,DDX23是E2F1的直接转录激活靶点。本研究筛选出DDX23诱导浆液性卵巢癌恶性表型的下游关键执行者F0XM1,阐明了DDX23促进裝液性卵巢癌恶性进展的分子调控机制。本研究的局限性和不足1.本研究尚未在卵巢癌耙向药物耐药、肿瘤免疫微环境等热点问题上对DDX23的功能进行深入研究。目前己有后续实验计划,延续本课题,对上述方向进行研究。2.目前尚未开发靶向DDX23的小分子抑制剂或相关反义寡核苷酸药物。因此,无法应用人源肿瘤异种移植（Patient-derived tumor xenograft,PDX）模型进行体内肿瘤抑制实验。3.本研究仅研究了DDX23对F0XM1表达的调控作用。DDX23作为重要的核心剪接因子,调控模式多样复杂。DDX23可能直接或间接调控更多的靶基因,未来可进行RIP-seq、CLIP-seq等实验,寻找更多DDX23发挥RNA加工作用的下游关键靶基因并研究对应的RNA结合基序。