柠檬酸对粘质沙雷氏菌产过氧化氢酶的影响及其机理

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过氧化氢酶(catalase,简称CAT)能够高效催化H2O2分解为水和氧气,在食品工业、纺织、造纸等领域都有重要应用。在优化一株粘质沙雷氏菌发酵产过氧化氢酶的培养基成分时发现柠檬酸可以显著提高该菌胞内CAT的活力。为了探讨柠檬酸促进粘质沙雷氏菌合成胞内CAT的机制,论文以Serratia marcescens SYBCT02为研究材料,比较了添加柠檬酸条件下细胞产CAT及其与抗氧化或氧化胁迫的关系等,取得了以下主要结果:(1)考察了柠檬酸浓度对粘质沙雷氏菌过氧化氢酶产量的影响。结果显示,柠檬酸浓度为20 g/L时,S. marcescens SYBCT02的CAT活性比对照提高约4倍,同时柠檬酸也能促进粘质沙雷氏菌菌株SYBC08和SYBCYH的过氧化氢酶活性,表明柠檬酸促进粘质沙雷氏菌过氧化氢酶的产量这一现象在粘质沙雷氏菌中具有一定的普遍性。(2)分别以等摩尔碳含量(0.72 mol/L)的柠檬酸、葡萄糖、柠檬酸与葡萄糖的混合物作为碳源,测定不同碳源条件下发酵产CAT时S. marcescens SYBCT02细胞内抗氧化的相关指标。结果显示,添加柠檬酸后,菌体胞内H2O2和羟自由基含量均比对照组(葡萄糖)高;同时,含有柠檬酸的培养基中该菌过氧化氢酶和其他抗氧化酶水平也较高。说明柠檬酸代谢物对该菌产生了活性氧胁迫,进而诱导更多CAT的合成。考察了甲萘醌和百草枯(活性氧O2-的来源物)对该菌合成CAT的影响,进一步验证了适量的活性氧能够诱导该菌合成CAT的推论。(3)深入分析柠檬酸对粘质沙雷氏菌代谢过程的影响。测定三种不同培养基中粘质沙雷氏菌对碳源的吸收速率以及代谢途径中相关酶的活性,进一步探究复合碳源(柠檬酸与葡萄糖)更有利于该菌产CAT的原因。结果显示,复合碳源时粘质沙雷氏菌对柠檬酸的吸收速率高于单一碳源时的柠檬酸吸收速率,说明复合碳源中的葡萄糖存在有利于细胞对柠檬酸的吸收。柠檬酸作为重要的中间物质,进入细胞后可以调控三羧酸循环途径中各项酶的水平,间接影响糖酵解和戊糖磷酸途径。实验结果表明柠檬酸会抑制糖酵解途径而促进三羧酸循环及戊糖磷酸途径。整个代谢过程中,复合碳源中的柠檬酸与葡萄糖通过不同代谢途径为提高粘质沙雷氏菌的过氧化氢酶产量做出贡献。(4)通过PCR法克隆出S. marcescens SYBCT02的过氧化氢酶基因,并在大肠杆菌中实现其表达。得到的S. marcescens SYBCT02的CAT基因与S. marcescens SYBC08的CAT基因相似度高达98%。柠檬酸能够显著促进S. marcescens SYBCT02的过氧化氢酶产量,但并不能显著提高重组大肠杆菌的过氧化氢酶产量。
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