很多研究将Sertoli细胞在神经前体细胞分化中的作用归结为Sertoli细胞分泌的细胞因子和营养因子等分泌物上,而从Notch信号转导系统角度,通过Notch受体与配体的相互作用,来探讨细胞与细胞间的相互接触在神经前体细胞分化中的意义,国内外尚未见报道。因而我们从Notch信号转导相关分子方面,对Sertoli细胞在神经前体细胞分化作用机理进行了深入研究。现将四部分内容分述如下:第一部分:大鼠大脑皮质神经前体细胞的分离培养及其增殖分化特性鉴定目的:神经前体细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力,在特定条件下,能够向特定类型神经元或神经胶质细胞分化的细胞。本实验通过体外分离和培养大鼠大脑皮质神经前体细胞,对神经前体细胞增殖和分化特性进行鉴定。方法:分离2周龄大鼠大脑皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的分化特性进行鉴定。结果:诱导神经前体细胞增殖的有丝裂原包括碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等。我们的实验结果表明EGF、bFGF和GDNF可促进神经前体细胞的增殖及神经球的克隆形成,并获得了Nestin阳性的神经前体细胞,其可分化为分别表达β-III tubulin、GFAP和GalC的阳性细胞。结论:神经前体细胞在体外大量扩增后,植入脑组织内或通过基因重组后再植入脑内,可用来治疗神经系统疾病,如帕金森病或阿尔茨海默病。中枢神经系统中神经前体细胞的增殖与分化是一个复杂的进程,存在细胞自身基因调控和外来信号调控两种机制。因而,目前需要积极寻找可靠的方法来有效地分离和扩增神经前体细胞,并精确地了解其增殖与分化特性。本研究第一部分利用大鼠的大脑皮质分离培养神经前体细胞,观察了bFGF、EGF和GDNF三种生长因子对神经前体细胞在体外培养增殖和分化的影响,体外分离和培养的大脑皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中培养,具有不断增殖和多向分化的能力,符合神经前体细胞的特点,为神经前体细胞的定向分化研究奠定了基础。第二部分:Sertoli细胞对大鼠大脑皮质神经前体细胞的诱导分化作用研究目的:同一来源的神经前体细胞移植到不同部位后,其分化结果也不相同,但往往与接受移植部位的细胞相似,提示外来信号调控作用的重要性。而且,在不同因素影响下,神经干细胞还具有横向分化潜能。本部分主要研究Sertoli细胞对体外培养大鼠大脑皮质神经前体细胞生长分化的作用特点,及向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法:将大鼠Sertoli细胞与14d大鼠皮质神经前体细胞体外共培养,免疫组化检测神经干细胞标记物Nestin ,神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞标记物β-Ⅲtubulin、GFAP和GalC,及多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果:随着共培养时间的延长,神经干细胞中GFAP阳性细胞数量逐渐减少,而β-Ⅲtubulin阳性细胞数增多,并出现TH阳性的神经元。结论:把胎鼠或成年鼠前脑神经干细胞移植给经亚致死量照射破坏了造血系统的同种宿主的骨髓,发现后者出现了供者源性的骨髓样细胞、淋巴细胞和早期的造血干细胞;把从人胚胎和成年小鼠快速分离的神经干细胞与成肌细胞共培养,结果神经前体细胞分化为骨骼肌细胞。证实了神经干细胞有着更大的分化潜能。Clarke等发现,成年鼠脑的干细胞能在鸡胚环境中被诱导形成所有的胚层。这些研究结果显示,环境的指导性信号对神经干细胞分化的重要作用。我们的实验结果表明:Sertoli细胞抑制体外培养的大鼠皮质神经前体细胞的生长,但具有显著的促神经元分化的作用,并能够诱导与其共培养的大鼠大脑皮质神经前体细胞分化为多巴胺能神经元。第三部分:Sertoli细胞共培养大鼠大脑皮质神经前体细胞分化中Notch信号相关基因表达分析目的:对那些在发育期调控细胞决定和细胞分化的基因进行了深入研究,发现Notch信号转导通路是具备这些功能的重要家族之一。它在大量的组织和器官的发育中发挥重要作用,调控着组织类型及形态的发生。本部分研究主要检测与Srtoli细胞共培养条件下大鼠大脑皮质神经前体细胞分化过程中Notch信号相关分子的表达变化,分析Notch信号途径在神经前体细胞分化过程中的可能作用。方法:本实验通过神经前体细胞与Srtoli细胞共培养,用Real-time PCR相对定量法,以β-actin为内对照,分别检测Notch受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4,及其配体Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2,以及Hes1、Ngn1基因的表达变化。结果:养细胞汇片后第5d, sertoli细胞Notch1～4基本表达维持不变;其配体Jagged2表达较高,但不表达Delta1;同时也不表达Hes1、Ngn1。神经前体细胞Notch表达水平较高,尤以Notch1为高;而其配体以Jagged1、Jagged2表达较高,前神经因子Hes1相对有较高的表达,而Ngn1表达较低。细胞共培养条件下,Notch受体、配体以及Hes1与神经前体细胞组相比都有明显的下调,而Ngn1却相对有所提高。结论:在干细胞发育过程中,细胞膜表面分子Notch通过结合其配体Delta或Jagged而在干细胞和周围细胞间传递信号,这种细胞间的相互作用可以调控干细胞的分化。在哺乳动物,Notch信号通过CBF1激活E(spl)的同源物Hes[Hairy and E(spl)]1/5,并影响Ngn(Neurogenins)等前神经因子的表达,从而调节神经干细胞的分化。Notch在细胞间传导相互作用的信号,并通过这种邻近细胞间的信号传递来精确调控各谱系细胞分化。Notch信号通路在哺乳动物CNS发育中参与神经发生过程,决定着CNS祖细胞是选择继续增殖还是向神经元分化。一般而言,Notch信号转导通路的激活维持神经干细胞的稳定状态,抑制定向分化;但另一方面,也有证据表明激活Notch信号转导通路又可以加速并不可逆地促进神经干细胞向成胶质细胞分化。本研究第三部分应用实时荧光定量PCR法,检测了与sertoli细胞共培养神经前体细胞分化过程中Notch相关基因Notch1～4、Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2、hes1和ngn1的表达变化,实验表明在与sertoli细胞共培养条件下,神经前体细胞的分化特点与Notch信号相关分子的表达变化相关。Sertoli细胞可通过Notch配体的作用,调节神经前体细胞Notch信号分子的表达。在共培养条件下,Sertoli细胞对神经前体细胞Hes1表达有抑制作用,但对Ngn1有正向调节作用,从而影响神经前体细胞的分化。第四部分:Hes1基因真核表达载体的构建及瞬时表达在大脑皮质神经前体细胞分化中的作用目的:随着神经前体细胞分离、提纯及体外培养等研究的深入,对内在和外在因子控制神经前体细胞增殖和分化的研究也取得了显著进步。目前研究证明,发生在不同组织内的同一机制调控着该关键步骤,而其中涉及最多者为bHLH基因家族。bHLH是一组转录因子,通过一个碱性区域和一个HLH域的异二聚化与DNA形成特定的接触。Notch信号的下游基因E(spl)/Hes就是其中之一。本实验通过克隆大鼠Hes1基因并构建真核表达载体pCDNA3.1-Hes1,将重组质粒转染大鼠大脑皮质神经前体细胞,获得高表达Hes1基因的神经前体细胞克隆。以探讨Hes1基因高表达对神经前体细胞分化的影响。方法:从大鼠脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得Hes1基因的全长cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染原代培养的神经前体细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,采用RT-PCR方法鉴定Hes1基因在神经前体细胞基因组中的存在,实时荧光定量PCR检测Hes1基因的过表达情况。结果:经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR证明经G418筛选得到的转基因神经前体细胞克隆的基因组DNA中存在Hes1基因,实时荧光定量PCR进一步证明转基因神经前体细胞Hes1基因的mRNA呈高表达。结论:不同的bHLH因子具有不同的决定和分化的功能,经常作为一个相关蛋白质家族而存在,按时空顺序短暂表达于细胞系分化的不同阶段。早期表达因子参与祖细胞的决定,而晚期表达因子则参与分裂细胞的终期分化,早期表达蛋白质激活晚期蛋白质表达。研究显示,Notch和它的下游效应器Hes基因,以及同源基因Emx2具有维持脑内多潜能干细胞状态的功能,而Ngn1/2和Mash1和Pax6是神经前体细胞向神经元分化的必要条件。Kabos等发现阻断Hes1表达促进中枢神经干细胞分化为γ-氨基丁酸神经元。神经元形成后,Hes因子的激活促进星形胶质细胞的分化,而前神经bHLH因子Ngn抑制星形胶质细胞的分化。本实验通过克隆大鼠Hes1基因,构建真核表达载体pCDNA3.1-Hes1,并将重组质粒转染大鼠大脑皮质神经前体细胞,研究观察了Hes1基因过表达对神经前体细胞Ngn1表达的影响,以及这些变化在神经前体细胞分化的作用。实验成功构建了大鼠Hes1基因的真核表达载体,获得了稳定表达Hes1基因的神经前体细胞克隆,细胞培养实验表明:Hes1基因高表达可抑制神经前提细胞Ngn1的表达,并促进神经前提细胞向神经胶质细胞的分化。