黑色素（melanin）是一类普遍存在于自然界的天然色素,它由酚类或吲哚类物质聚合而成。尽管黑色素不是生物体所必需,但其具有光吸收、防辐射、清除自由基等多种功能,能够为生物体提供生存优势。许多研究发现黑色素与阿兹海默症、白化病等疾病密切相关,因此,黑色素合成机制与生物学功能的研究一直以来备受人们关注。而过氧化氢酶（catalase,CAT）作为重要的抗氧化酶,普遍存在于需氧生物中,它能高效清除一类重要活性氧（reactive oxygen species,ROS）—H2O2,对生物体维持正常ROS水平至关重要。中间气单胞菌WS是本实验室从武汉东湖分离得到的一株黑色素高产菌株,前期实验证实,该菌株可通过尿黑酸（homogentisate,HGA）途径形成脓黑色素。将HGA途径的关键酶编码基因hpp D敲除后,突变菌株完全失去产黑表型,说明脓黑色素是该菌的最主要色素。但在该菌培养液中同时也检测到特征性中间产物多巴（DOPA）及DOPA黑色素标志物的存在,说明该菌也能产生少量DOPA黑色素。此前曾一度认为WS菌株中过氧化氢酶（Kat E）可能与DOPA黑色素形成有关。但有意思的是,实验证明kat E敲除突变株的DOPA合成能力并未受到影响。相反,却使细菌黑色素合成下降约一半,而且合成过程提前,这一结果表明Kat E以某种方式影响脓黑色素的合成。本研究旨在探究Kat E影响黑色素合成的原因。首先通过比较敲除突变株WSΔkat E与野生型菌株的生长曲线,发现敲除突变株的生物量似乎未受到影响。通过Real-time PCR检测HGA途径相关基因的转录情况,结果表明WSΔkat E的转录水平未受明显影响。而在实验中,无法提取培养24 h后WSΔkat E的总RNA,因此猜测菌株生长状态可能受到了影响。通过检测WSΔkat E和不产黑菌株WSΔkat EΔhpp D活菌数,发现WSΔkat E在稳定期（24 h左右）突然死亡,WSΔkat EΔhpp D却并未死亡,而这段时间菌株正在大量合成黑色素。综上,确定了敲除突变株WSΔkat E黑色素合成减少的原因是菌株在培养至稳定期（24 h左右）发生突然死亡,黑色素合成或Hpp D蛋白是造成其死亡现象的关键原因。将WSΔkat E基因组上HGA途径中的各个基因分别进行敲除,发现仅能造成黑色素部分减产的WSΔkat EΔphh A、WSΔkat EΔtyr B均发生死亡;而失去产黑表型的WSΔkat EΔtyr BΔasp C与WSΔkat EΔhpp D都能挽救死亡。因此,证实是黑色素合成过程造成WSΔkat E提前死亡。在此基础上,进一步探究WSΔkat E在不同培养条件的生长情况,发现WSΔkat E提前死亡与通氧量有关。结合Kat E具有清除ROS的功能,通过检测WSΔkat E、WSΔkat EΔhpp D培养19-24 h的胞内ROS水平,发现WSΔkat E的ROS水平急剧升高,且远高于野生型菌株WS与WSΔkat EΔhpp D,而此时WSΔkat E正在大量合成黑色素。由此可以确定,kat E缺失导致菌株清除ROS能力下降,而黑色素在短时间内大量合成,同时会产生大量ROS,造成氧化压力过大,最终导致WSΔkat E提前死亡。另外,在合成黑色素的杀鲑气单胞菌AB98041中也发现了同样因kat E缺失导致菌株提前死亡的情况,说明这种现象具有一定的普遍性。我们对WSΔkat E的提前合成黑色素的原因也进行了探究。通过HPLC检测胞外的HGA,发现WSΔkat E相比于野生型,HGA特征峰提前消失,即提前发生自氧化,最终导致黑色素合成提前,这可能与胞外氧环境的变化相关。另外,前期通过电镜观察发现,WSΔkat E死亡后细胞形态仍保持完整。设想将该菌株作为生物反应器应用于工业生产中。在胞内尝试表达了两种工业酶,粗酶液酶活结果表明WSΔkat E与野生型相比,酶活并未受明显影响甚至更高。初步证明了WSΔkat E作为生物反应器的可行性。综上所述,本研究揭示了过氧化氢酶在黑色素合成中的重要作用,丰富了对黑色素合成过程的认识,为黑色素生理学功能的应用开发奠定了基础。而且加深了对气单胞菌在水生环境中的进化适应性策略的理解,为工业化特色发酵菌株的构建提供了新思路。