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原发性肝癌是我国最常见恶性肿瘤之一,由于起病隐匿、早诊困难及进展迅速,大于80%的患者就诊时已届中晚期,治疗棘手,预后很差。原发性肝癌90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。迄今为止,肝癌的药物治疗还存在诸多未知领域和困难,不懈地探求有效且耐受良好的肝癌治疗新药仍是一项持续性工作。发挥中医药的优势,探寻高效的抗肝癌药物并阐明其抗肿瘤的分子机理,对于提高肝癌疗效有着积极的意义。告达庭(caudatin)是从传统补益类中药白首乌中提取的一种C21甾体苷元,其具有较强的体内外抗肿瘤活性的研究已有部分报道,体外研究表明告达庭对人肝癌细胞株SMMC-7721的生长有明显的抑制作用,但关于其抗肝癌作用的详细机制还需深入研究。本论文通过研究告达庭在体内外对肝癌细胞的生物学功能的影响,进一步观察了其对肝癌的作用并探讨了其作用机制。 第一部分理论研究 目的:探讨肝癌的病因病机和防治方药特点及规律,加强中医对肝癌的认识,以利于指导临床治疗。方法:研究、整理古代经典医籍中肝癌相关病证的论述及近年来中医药防治肝癌的文献和研究现状。结果:古代医家对肝癌病因病机的认识主要包括外邪侵袭、饮食不节、起居不慎、正气不足、脏腑亏虚、情志所伤等几个方面;现代医家认为肝癌的基本病理特征可概括为虚、毒、瘀、痰、湿、热;在肝癌发生、发展过程中,癌毒、湿热、痰浊、瘀血、水饮往往胶结错杂,互相影响。古今用药各有侧重,治疗应注重扶正祛邪,标本兼顾。结论:中医药防治肝癌的思路在于治本责脾肾,扶正以祛邪;辨病与辨证结合,分期施治,突出扶正、祛邪之侧重,有的放矢;病机复杂多重,治宜复法合方。 第二部分告达庭抑制肝癌SMMC-7721细胞生长的体外研究 目的:研究告达庭在体外对肝癌细胞生长和转移的影响。方法:MTT比色法检测告达庭对肝癌细胞SMMC-7721细胞抑制活性;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;Western blot检测β-catenin、GSK3β、MMP-2、MMP-9蛋白表达;qPCR检测Cyclin D1、COX-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表达;Transwell小室实验检测细胞转移率。结果:体外细胞实验中告达庭对SMMC-7721细胞具有明显的抑制其生长的作用,24 h时IC50值为89.49μM,48 h时IC50值为54.43μM,72 h组的IC50值为118.07μM,生长抑制作用呈剂量和时间依赖关系;流式细胞术的结果显示告达庭可引起肿瘤细胞阻滞于细胞周期进程的G1期,与空白组对照,低、中、高剂量组细胞凋亡率分别提高到10.67%、17.65%、22.52%;β-catenin、GSK3β、MMP-2、MMP-9蛋白和Cyclin D1、COX-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表达显著下降;与空白组对照低、中、高剂量组肿瘤细胞的转移率分别下降至9.85%、7.71%、7.29%。结论:体外实验证明告达庭对人肝癌SMMC-7721细胞有较强的生长抑制作用,可明显降低肝癌细胞的转移能力,其作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。 第三部分告达庭抑制肝癌SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤的体内研究 目的:人肝癌细胞皮下移植动物模型观察告达庭对动物体内肿瘤生长的影响。方法:建立裸小鼠皮下异种移植瘤模型,低、高剂量组分别灌胃50、100 mg/kg告达庭,15天后处死,称体重、瘤重,计算抑制率;免疫组化分析Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白MMP-2、VEGF、COX-2、β-catenin的变化情况。结果:告达庭低、高剂量组肿瘤抑制率分别为74.72%(P<0.01),60.84%(P<0.01);与空白组比较低、高剂量组VEGF表达下调至5.07%、7.10%; MMP-9表达下调至4.41%、5.38%; COX-2表达下调至3.01%、6.56%;β-catenin表达下调至9.02%、11.11%。结论:告达庭可显著抑制人肝癌SMMC-7721荷瘤裸鼠肿瘤的生长,降低裸鼠移植瘤内β-catenin、MMP-2、VEGF、COX-2的表达。 通过本论文的研究,从体内外证实了告达庭具有较强的抗肝癌作用,初步揭示其通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移而发挥抗肝癌作用机制,为将告达庭及其衍生物开发成为有效的抗肿瘤药物奠定了理论基础。