【摘 要】
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水稻(Oryza sativa L.)是一种主要的粮食作物,目前我国人民的生活水平逐步提高,人们对稻米品质的要求也开始提高。通过基因工程等分子育种技术培育优质水稻品种具有重要意义。胚乳是水稻种子营养物质贮藏的最主要场所,其中淀粉是胚乳的最主要组成成分,淀粉的含量、类型和理化性质直接影响稻米的品质。越来越多的证据表明,转录因子在调控淀粉的生物合成方面起着重要的作用。目前对NF-YB和NF-YC这两个
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水稻(Oryza sativa L.)是一种主要的粮食作物,目前我国人民的生活水平逐步提高,人们对稻米品质的要求也开始提高。通过基因工程等分子育种技术培育优质水稻品种具有重要意义。胚乳是水稻种子营养物质贮藏的最主要场所,其中淀粉是胚乳的最主要组成成分,淀粉的含量、类型和理化性质直接影响稻米的品质。越来越多的证据表明,转录因子在调控淀粉的生物合成方面起着重要的作用。目前对NF-YB和NF-YC这两个亚基的研究较多,对NF-YA亚基的研究报道相对较少,在水稻中的功能研究至今也是鲜有报道。本课题以OsNF-YA8为候选基因,在克隆该基因的基础上,进行了生物信息学和基因的表达模式分析,并且分析了该基因编码蛋白的亚细胞定位,构建了超表达载体并转化水稻,然后验证OsNF-YA8基因的功能,改良稻米的品质。以下是本研究的主要结论:(1)OsNF-YA8基因的克隆、表达模式和生物信息学分析1)以水稻野生型(中花11号)为研究对象,提取了水稻m RNA,并反转录成c DNA,以c DNA为模板,克隆了OsNF-YA8基因。利用荧光实时定量(real-time quantitative RT-PCR),分析水稻在生长过程中不同组织器官的OsNF-YA8基因表达情况。结果表明OsNF-YA8在水稻灌浆期的穗中表达量最高。2)生物信息学分析结果表明,OsNF-YA8基因全长501 bp,编码166个氨基酸组成的蛋白质,其二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成;OsNF-YA8蛋白是一种亲水性蛋白,有1个Tyr磷酸化位点、5个Thr磷酸化位点和9个Ser磷酸化位点,并且可能定位在细胞核;基因的上游启动子区域还存在与胚乳发育相关的元件AACA_motif和GCN4_motif,以及α-淀粉酶启动子的保守序列A-box。进化树分析和氨基酸序列同源性比对分析结果表明,OsNF-YA8基因在结构上是相对保守的,具有NF-YB/-YC interaction和DNA binding结构域,并且OsNF-YA8与拟南芥的At NF-YA1基因亲缘关系最近。(2)OsNF-YA8基因编码的蛋白的亚细胞定位研究构建了35S::OsNF-YA8-GFP融合表达载体,并在洋葱表皮细胞瞬时表达。结果表明,OsNF-YA8基因编码的蛋白定位于细胞核。(3)OsNF-YA8上调表达对水稻籽粒形态的影响构建了35S::OsNF-YA8超表达载体,并获得了35S::OsNF-YA8转基因植株。对35S::OsNF-YA8转基因植株T1代的种子进行观察和统计,结果表明,与野生型的种子相比,转基因水稻籽粒的粒长比野生型水稻籽粒的粒长更长,粒厚比野生型的小,而两者的粒宽和千粒重没有显著差异。说明OsNF-YA8基因的上调表达能改变水稻稻米的形态,但不影响水稻的产量。(4)OsNF-YA8基因上调对水稻淀粉代谢和其他糖代谢相关基因表达的影响检测了超表达OsNF-YA8水稻中与淀粉代谢相关以及其他糖代谢相关的15个基因的表达。结果显示,Os AGPL2、Os AGPS1、Os AGPS2b、SBEI、SBEIII、Os SSI、Os SSIIa、Os SSIVa、ISA1和Su Sy1、Su Sy6、Os SUT1、Os SUT4在超表达株系中均出现了上调,而Os AGPL1和ISA2基因在三个超表达株系中与野生型株系相比均未表现出显著性差异。(5)OsNF-YA8上调表达改良了稻米的品质提取了35S::OsNF-YA8转基因水稻籽粒和野生型水稻籽粒的淀粉及蛋白质,并检测了相关理化性质及含量。结果表明,过表达OsNF-YA8水稻种子的淀粉粒平均粒径小于WT种子的粒径。总淀粉含量、直链淀粉和支链淀粉均高于WT种子。过表达OsNF-YA8的稻米中占主体成分的谷蛋白和醇溶蛋白含量与野生型没有显著性差异,清蛋白和球蛋白含量与野生型相比有明显下降,但稻米中总蛋白的含量与野生型比没有显著性差异。
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