背景及目的三氯乙烯（Trichloroethylene,TCE）是一种生产环境中常见的有机污染物,属于人类Ⅰ类致癌物。本课题以人永生化肝细胞为模型,研究TCE诱导细胞恶性转化效应及其潜在机制,并根据筛选的靶分子设计合成新型姜黄素衍生物B5,进一步探讨B5对恶性转化的逆转效果,有望为TCE职业暴露预防与控制提供理论基础。研究方法人永生化THLE-2暴露于5 mMTCE培养30代,获得THLE-2-TCE细胞。细胞水平研究细胞形态学、生长动力学、增殖迁移能力和基因组差异;动物水平观察THLE-2-TCE异种移植于BALB/c裸鼠后的成瘤潜力、新生物组织病理学和分子生物学（cytokeratin和Ki-67）。随后通过氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）来探讨氧化应激的生成及其对细胞恶性转化过程的调控作用;在此基础上,结合Label free定量结果,采用通路蛋白抑制剂和si-RNA慢病毒干扰等技术探究TCE诱导细胞恶性转化的可能分子机制。最后,根据筛选的分子机制靶点（AKT、NFκB）,利用孪药设计的化学方法合成新型姜黄素衍生物B5,通过分子对接和分子动力学模拟,综合评估B5逆转细胞恶性转化的效应并再次验证所筛选的靶分子机制。研究结果（1）THLE-2-TCE细胞恶性转化相关生物学表征:（1）形态学表征:THLE-2-TCE细胞部分重叠生长,细胞大小不一,呈长梭形且有长长的突起,可见多核巨细胞,细胞形态异化明显。（2）生物功能表征:THLE-2-TCE细胞倍增时间（49.92±0.49 h）较对照组（75.06±1.71 h）明显缩短;克隆增殖能力增强;细胞24 h平均迁移率（76.67%）、穿膜细胞数目（525.00±13.04个）明显高于对照组（20.83%和114.00±6.78个）,以上差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）生物表型改变:Label free蛋白定量结果显示THLE-2-TCE细胞基因组不稳定。细胞增殖分化、迁移侵袭和抗凋亡正相关蛋白（IGF2R、EIF4EBP1、FAM195B、ZNF185、BCAT1等）表达显著升高;原癌基因（AKAP8、BCL2L1、AXL、JUND、AKT2等）高表达,而抑癌基因（BCAR1、SAMD9、BCAR3、NFXL1、UIMC1等）表达显著降低。差异蛋白功能主要富集在物质间（如蛋白质、核酸、生物酶和杂环化合物等）的结合反应;氧化磷酸化、细胞存活和细胞周期等信号网络的共性通路,如TGFβ1/SMAD、MAPK、PI3K/AKT/m TOR和NFκB等通路异常活化。综合以上分析结果,表明THLE-2-TCE细胞具有恶性转化相关生物学活性。（4）裸鼠成瘤实验:传代对照THLE-2细胞没有形成新生物,THLE-2-TCE细胞新生物形成率为40.00%,终点体积为406.17±76.98 mm~3,HE染色显示细胞形态不规则,核深染,且异型较明显,但不及Hep G2阳性对照组显著。cytokeratin染色阳性,系上皮细胞来源。Ki-67阳性细胞比例较高,细胞增殖能力强。THLE-2-TCE细胞裸鼠荷瘤模型的建立,表明该细胞具有一定的体内成瘤潜能。（2）THLE-2-TCE细胞恶性转化潜在分子机制:（1）TCE染毒过程中,THLE-2细胞内ROS、gp91 phox mRNA转录和蛋白水平均升高。MDA、SOD水平增加。KEAP1表达持续降低,而Nrf2和HO-1表达上调,表明抗氧化系统被激活。NAC预处理的细胞迁移率（32.33±6.13%）、侵袭数（352.00±41.41个）和克隆形成率（230.67±12.04%）,分别低于TCE诱导组（47.67±6.13%）、（644.00±39.23个）和（484.00±16.57%）。裸鼠成瘤实验中,NAC预处理组成瘤率为20.00%,低于TCE诱导组（40.00%）,且新生物生长速率、终点体积（173.54±26.39 mm~3）和Ki-67阳性细胞数都不及TCE诱导组。（2）蛋白质定量和KEGG分析发现THLE-2-TCE细胞TGFβ、AKT、NFκB等分子显著上调。NFκB si RNA细胞克隆形成、侵袭和迁移能力降低,增殖蛋白cyclin D1表达增加。此外,AKT抑制剂MK-2206和TGFβR抑制剂LY364947处理后,THLE-2-TCE细胞内AKT和NFκB的表达明显下调。TGFβ1刺激后THLE-2细胞内AKT和NFκB表达呈浓度依赖性上调。NAC预处理抑制TGFβ/AKT/NFκB通路活化。以上结果表明ROS可能通过调控TGFβ/AKT/NFκB信号轴参与TCE诱导的恶性转化。（3）姜黄素衍生物B5与AKT的结合自由能（-55.02±3.22 Kcal/mol）是姜黄素（-27.06±3.22 Kcal/mol）的两倍之多,其亲和力（-6.28 Kcal/mol）也强于姜黄素（-3.57 Kcal/mol）。B5可诱导细胞形态由长梭形、星形转变为饱满的多边形,细胞突起明显减少和缩短。B5（0、2、4和8μM）克隆形成率分别为98.67±3.40%、51.47±6.69%、37.82±4.85%和17.00±6.68%。B5（0、5、10和15μM）细胞侵袭率为96.67±7.72%、55.00±9.80%、34.00±6.53%和11.33±3.40%,G2/M期阻滞比例为18.29%、38.87%、57.21%和60.73%。ROS荧光强度呈浓度依赖性减弱且Nrf2、HO-1表达上调;TGFβ1、AKT、NFκB表达受抑。这些结果提示,B5可能通过清除ROS和抑制AKT/NFκB从而发挥对THLE-2-TCE细胞的抗增殖、抗迁移和逆转恶性转化效果。结论（1）TCE长期染毒可诱导THLE-2细胞出现恶性转化表征,细胞迁移、侵袭和锚定生长能力增强,并具有裸鼠成瘤性。（2）TCE暴露可诱导ROS持续生成,ROS调控TGFβ/AKT通路活化,随后促进NFκB核转录,诱导细胞周期蛋白的表达,促进细胞恶性增殖,提示ROS/TGFβ/AKT/NFκB信号轴可能是TCE暴露诱发人肝细胞恶性转化的重要毒理机制之一。（3）姜黄素衍生物B5可清除THLE-2-TCE细胞中的ROS,通过Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化效应,通过靶向AKT、抑制NFκB表达来逆转TCE诱导的细胞恶性转化。TCE暴露诱导的ROS,及其下游信号通路TGFβ/AKT/NFκB的活化,可能是诱发THLE-2细胞恶性转化的重要毒理机制之一。通过孪药设计、化学合成新型姜黄素衍生物B5,结合计算机模拟等工程思维证明B5能够清除细胞内ROS和靶向AKT来逆转TCE诱导的细胞恶性转化,可以作为精准靶向防治TCE职业性肝细胞恶性转化的候选药物。本研究为TCE暴露的潜在致肝细胞恶性转化作用提供了新的实验依据,为进一步阐明TCE致肝细胞恶性转化的致病机理提供了研究思路,具有一定的职业性肝病防治价值。图38表28参225