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背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)越来越常见，据报道其发病率居恶性肿瘤发病率的前五，而其致死人数居每年恶性肿瘤致死人数的前三。我国是肝细胞癌(以下简称肝癌)的高发地区，而慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染经流行病学研究证实是我国原发性肝癌的第一大致病因素。慢性乙型肝炎病毒感染进展为肝硬化，最终进展为肝癌是HBV相关原发性肝癌发生发展的常规过程，但其中的机制研究仍未取得突破性进展。而由HBV X基因编码的乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus Xprotein, HBx)被认为密切地参与了这一过程。HBx是由HBV X基因编码的多功能蛋白，广泛参与多种基因转录调控、细胞增殖转化、细胞信号转导等一系列过程。就目前而言，肝癌的具体发病机制仍未完全明了。普遍来说，肝癌的发生是一个多因素影响、多机制参与的过程。这些复杂的因素及机制被传统肿瘤发生理论归纳为正常肝细胞在各种致癌因素下，正常的生理机制被破坏，发生异常的转化导致肝癌的发生。而近些年来新提出的肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)理论为肝癌的发生阐释了另一个角度的可能。简单而言，肿瘤干细胞理论认为肿瘤由肿瘤干细胞分化而来，而肿瘤干细胞则可能源于各种因素及机制作用下的正常的干细胞异常转化。肝卵圆细胞(hepatic oval cell, HOC)作为一种具有多方向分化潜在能力的肝内细胞，被公认为肝干细胞。一系列研究提示肝卵圆细胞(以下简称卵圆细胞)可能参与了原发性肝癌的发生，在肝癌发生发展中起着重要作用。目的研究HBx对肝卵圆细胞的转化作用，探讨HBx是否能诱导卵圆细胞向肝癌细胞转化。方法1构建表达HBx和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体LV-HBx-PM和对应的仅表达嘌呤霉素抗性基因的空慢病毒载体LV-PM。分别用构建好的慢病毒LV-HBx-PM和LV-PM感染WB-F344卵圆细胞。将感染慢病毒LV-HBx-PM的WB-F344卵圆细胞标记为WB-F344-HBx，设为实验组；将感染对照慢病毒LV-PM的WB-F344卵圆细胞标记为WB-F344-PM，设为阴性对照组；将未感染病毒并且培养相同代数的WB-F344卵圆细胞标记为WB-F344-Mock，设为空白对照组。经筛选培养，使用real-time RT-PCR和Western-blot分别在基因和蛋白水平检测HBx的表达。2使用流式细胞术检测WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock细胞的细胞周期。3使用MTT法检测WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock细胞的增殖能力。4使用Transwell法检测WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock细胞的迁移能力。5分别将WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock卵圆细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下，每组6只，接种6周后处死裸鼠，观察各组卵圆细胞成瘤的情况。6采用HE染色的方法观察移植瘤组织情况，用免疫组织化学染色检测移植瘤组织中HBx和AFP的表达。结果1WB-F344-HBx在基因水平和蛋白水平稳定高效表达HBx；WB-F344-PM和WB-F344-Mock不表达HBx。2实验组WB-F344-HBx与阴性对照组WB-F344-PM相比，G0/G1期细胞比例降低[(55.98±0.39)%vs.(63.73±2.02)%，P<0.01]，G2/M期细胞比例升高[(15.05±1.67)%vs.(7.41±0.38)%，P<0.01]。阴性对照组WB-F344-PM和空白对照组WB-F344-Mock相比，细胞周期无显著差异。3实验组WB-F344-HBx与阴性对照组WB-F344-PM相比，细胞增殖能力增强(P<0.01)。阴性对照组WB-F344-PM和空白对照组WB-F344-Mock相比，细胞增殖能力无显著差异。4在细胞迁移实验中，WB-F344-Mock、WB-F344-PM、WB-F344-HBx细胞均具有细胞迁移能力，透膜细胞数分别为249.60±17.28个/视野、42.50±14.34个/视野和35.30±10.00个/视野。实验组WB-F344-HBx与阴性对照组WB-F344-PM相比细胞迁移数目明显增多(P<0.01)，而阴性对照组WB-F344-PM与空白对照组WB-F344-Mock相比细胞迁移数目无显著差异。5接种后6周的饲养过程中，阴性对照组裸鼠死亡1只，其余两组裸鼠在饲养期内无死亡。实验组裸鼠成瘤(5/6例)，肿瘤直径7±1.9mm，阴性对照组裸鼠成瘤(0/5例)，空白对照组裸鼠成瘤(0/6例)。HE染色显示实验组移植瘤肿瘤组织呈侵润性生长。免疫组织化学染色显示实验组肿瘤组织HBx表达阳性，而AFP表达阴性。结合病理观察结果和免疫组织化学染色结果，排除移植瘤组织是肝癌，而是一种具有侵润性生长等恶性生物学特征的肿瘤。结论1经慢病毒转染的HBx可在WB-F344卵圆细胞中高效、稳定的表达。2HBx加快卵圆细胞周期，增强细胞增殖能力和迁移能力。3HBx能够诱导卵圆细胞恶性转化。