研究背景和目的:阿尔茨海默病(AD)是世界范围内引起65岁以上人群痴呆最普遍的病因。AD的特点是以进行性的神经元死亡,记忆丧失,思考语言功能退化和行为异常。AD在病理上具有两个明显的特征,即两种异常的病理病变形成,细胞外的淀粉样蛋白斑和细胞内神经元纤维缠结。虽然早发家族性AD有较为明确的致病基因,但是散发性AD的病因仍然不明确,遗传因素和环境因素都可能是潜在的致病因子。某种程度上,环境因素和遗传因素相互作用促进AD的发生和发展。最近的研究表明数个环境因素,比如杀虫剂的暴露,化学性溶剂,重金属的污染以及某些处方药物与AD的病理机制相关。在这些易感环境因素中,杀虫剂似乎是一种较为确切的环境致病因子。一项研究发现AD患者的血清中dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)的代谢物dichlorodiphenyldichloroethylene(DDE)浓度高出4倍左右。这一结果最近被另外一项600人的更大规模人群的研究得以重复。世界卫生组织重新推荐室内使用DDT喷雾来杀灭携带疟疾的蚊子。由于DDT的高度稳定性,DDT仍然存在于自然界和暴露的人群中,即使人群没有直接暴露于DDT中,也可以通过摄入DDT污染的食物而积蓄在体内。然而,现在仍然不清楚是什么分子机制介导了DDT对AD的作用。由于两项流行病学的调查研究表明了DDT和AD之间的联系,揭示它们之间的分子机制可能为治疗AD提供新的思路和方法。除了环境因素,一些新的遗传因素的作用引起了人们的注意。一些报道证实多个RNA结合蛋白在神经退行性疾病中发挥重要作用。其中,包括hnRNPA1和hnRNPA2B1的核不均一核糖核蛋白A/B(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins)家族成员最近得到了广泛的研究,它们也是细胞核中表达最高的蛋白之一。不断的证据表明,hnRNPA1蛋白在神经退行性疾病的发病机制中发挥着重要的作用。特别值得注意的是,最近的一篇报道证实,在家族遗传性累及肌肉,大脑,运动神经元及骨骼的退化的疾病和一例家族性肌萎缩侧索硬化的研究中发现在hnRNPA1的朊病毒样的结构域中发生突变。突变后的蛋白更易自我折叠进而聚集,丧失其正常的生理功能。在散发型AD病人的脑组织中的hnrnpa1表达显著下降,然而这种下降并不存在于帕金森病人或者癫痫病人的内嗅皮质中,说明这种蛋白水平的下降具有疾病特异性。但是hnrnpa1在ad发生发展中的具体机制仍不清楚。揭示hnrnpa1重要的生理功能以及在ad中的作用可能为ad的治疗提供新的分子靶点。基于以上背景,我们在本研究中通过分子生物学方法揭示了杀虫剂ddt和hnrnpa1基因在ad发生发展中的作用及其分子机制。为ad的进一步治疗提供了一定的理论基础。第一部分:目的通过分子生物学方法揭示ddt在ad发病机制中的作用方法(1)我们首先用ddt处理神经胶质瘤细胞h4-aβpp稳转细胞,利用westernblot的方法检测了细胞外β淀粉样蛋白(aβ)的生成和细胞内aβ生成途径重要蛋白的表达。(2)接下来我们使用qrt-pcr的技术检测了ddt处理神经胶质瘤细胞h4-aβpp稳转细胞后与aβ生成,清除以及蛋白降解相关的基因的mrna表达。(3)为了进一步探索ddt影响aβ代谢的机制,我们通过加入外源性人工合成的aβ,利用westernblot的方法检测了ddt对aβ细胞清除的影响。并通过质粒过表达系统,揭示了涉及其中的关键分子的作用。(4)最后我们通过ddt处理神经胶质瘤细胞h4细胞获得条件化培养基,并向此培养基中加入外源性人工合成的aβ,通过westernblot的方法检测了ddt对aβ细胞外蛋白酶解的影响。并通过酶活性试验和加入胰岛素抑制相应酶活性验证了其中的根本机制。结果(1)我们发现与对照组dmso处理组相比,ddt处理神经胶质瘤细胞h4-aβpp稳转细胞后促进了aβ的生成。同时增强了细胞中aβ生成途径中的关键蛋白aβpp和bace1的蛋白表达。我们也在成神经细胞瘤sh-sy5y细胞中发现ddt增强了aβpp和bace1的蛋白表达。(2)qrt-pcr结果提示,ddt处理神经胶质瘤细胞h4-aβpp稳转细胞后显著降低了ldlr的mrna水平。(3)通过加入外源性人工合成的aβ,我们发现ddt处理神经胶质瘤细胞h4后降低了细胞对aβ的清除并且降低了lrp1和abca1的蛋白表达。同时我们发现,过表达lrp1不能挽救ddt导致的aβ清除降低,而过表达abca1后挽救了ddt导致的aβ清除降低。此外,我们也在用ddt处理apoeε3胶质细胞和成神经细胞瘤sh-sy5y细胞后发现ddt降低了abca1的蛋白水平。(4)通过ddt处理神经胶质瘤细胞h4后得到条件化培养基并向其加入外源性人工合成的aβ,我们发现ddt减缓了aβ的细胞外降解。同时我们利用酶活性试验和预先加入胰岛素抑制ide活性证实了ddt通过间接方式抑制了ide的酶活性从而介导了aβ的细胞外降解降低。结论通过对ddt在ad中的作用研究我们得出以下结论:(1)ddt通过促进aβ的生成,降低aβ的清除和细胞外降解影响aβ的代谢。(2)abca1和ide是ddt重要的分子作用靶点。我们的研究揭示了ddt在ad发病机制中的作用,为流行病学调查的结果提供了一定的理论依据,同时为ddt暴露的ad患者的治疗提供了新的治疗作用靶点。第二部分:目的通过分子生物学方法揭示hnrnpa1与micrornas生成的关系以及在ad发病机制中的作用方法(1)我们首先用针对hnrnpa1的sirnas转染神经胶质瘤细胞h4细胞,利用qrt-pcr的技术检测了63个micrornas的表达。接着我们通过westernblot的方法检测了micrornas生成途径中的关键蛋白的水平。为进一步得到更加完整的结果,我们利用taqmanarrayhumanmicrornacards检测了大约500个micrornas的表达变化。(2)接下来我们在神经胶质瘤细胞h4细胞中用sirnas沉默hnrnpa1后,使用westernblot的技术检测了tau总蛋白和磷酸化tau的表达以及bace1的蛋白水平。我们也使用qrt-pcr的方法检测了其mrna水平。为了进一步阐明其调控机制,我们利用荧光素梅报告基因系统检测了pgl3-bace1-3’utr报告基因的活性变化。同时为了证明其通路,我们向h4细胞转染针对dicer和ago2的sirnas,然后用westernblot检测了tau总蛋白和bace1的蛋白水平。(3)我们利用经胶质瘤细胞h4-aβpp稳转细胞转染针对hnrnpa1的sirnas后,检测了细胞外aβ的生成。(4)我们利用alamarblueassay检测了神经胶质瘤细胞h4细胞转染针对hnrnpa1的sirnas后的细胞活力的变化。(5)最后我们通过处理ad病人和对照组病人内嗅皮质的组织,用westernblot检测了hnrnpa1,dicer和ago2的蛋白表达。结果(1)我们发现与对照组sirnas转染组相比,针对hnrnpa1的sirnas转染神经胶质瘤细胞h4细胞后成功的抑制了hnrnpa1的mrna水平。qrt-pcr的结果提示,在63个micrornas中,绝大多数的micrornas表达下降。为了探明其中的机制,我们用westernblot检测了micrornas生成途径中的关键蛋白,发现dicer和ago2的蛋白水平显著降低。为了更大范围内确认此结果,我们利用taqmanarrayhumanmicrornacards检测了大约500个micrornas的表达,同样发现绝大部分的micrornas表达下降。(2)在神经胶质瘤细胞h4细胞中沉默hnrnpa1后,westernblot的结果显示tau总蛋白增加,磷酸化tau蛋白表达增加,bace1蛋白增加。为了探明其中的机制,我们利用荧光素梅报告基因证实沉默hnrnpa1后,报告基因pgl3-bace1-3’utr的活性增强。在h4细胞中,分别沉默dicer和ago2后,增强了tau总蛋白和bace1蛋白的表达。(3)我们在经胶质瘤细胞h4-aβpp稳转细胞中沉默hnrnpa1后,增强了aβ的生成。(4)我们采用alamarblueassay检测了在神经胶质瘤细胞h4细胞中沉默hnrnpa1后,其细胞活力显著减低。(5)最后我们发现与对照组相比,ad病人的脑组织内嗅皮质中的hnrnpa1,dicer和ago2的蛋白表达显著降低。hnrnpa1分别与dicer和ago2的蛋白水平呈线性相关。结论通过沉默hnrnpa1研究其在ad中的作用,我们得出以下结论:(1)hnrnpa1通过影响dicer和ago2的蛋白水平在micrornas生成途径中发挥重要作用。(2)hnrnpa1通过micrornas调控ad发病机制中的重要蛋白tau,bace1和aβ。我们的研究揭示了hnRNPA1在microRNAs生成途径和AD发病机制中的作用,拓展了microRNAs生成途径研究的理论基础,同时为AD患者的治疗提供了新的治疗作用靶点。