目的:采用Transwell共培养系统,诱导人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)向髁突软骨样细胞分化,建立软骨细胞种子库,为颞下颌关节骨关节病的治疗探索新的途径。方法:1.采用机械分离和二步酶消化法分离乳兔髁突软骨细胞(MCCs),差速贴壁法纯化细胞,镜下观察细胞形态学特征,HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定MCCs。2.MCCs和HAMSCs以4:1的比例分别置于Transwell培养皿的上、下室,诱导培养7d、14d、21d,倒置显微镜下观察细胞形态、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定诱导后细胞,并计算平均阳性染色面积。结果:1.原代MCCs细胞为短梭、多角形,呈铺路石状生长,并逐渐聚集成簇,细胞生长周期约10d;二代MCCs细胞呈多角形、三角形,细胞质紫红染,细胞核蓝染,呈椭圆形或圆形,可见1-2个核仁;甲苯胺蓝染色见细胞质均匀蓝染,可见蓝紫色异染颗粒,细胞核深蓝染;Ⅱ型胶原免疫组化染色可见细胞质棕褐色异染颗粒,细胞核复染后呈深蓝染;生长周期缩短为5d。2.Transwell共培养系统中,诱导组共培养7d,下层细胞仍呈长梭状,甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色偶见异染颗粒;共培养14d,下层细胞形态多样,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色可见细胞内异染颗粒逐渐增多;共培养21d,下层细胞呈多角形,类MCCs样形态,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性;对照组细胞未见异染颗粒。3.Ⅱ型胶原平均阳性染色面积,MCCs组为35.8%,诱导组下层细胞平均阳性染色面积随共培养时间延长逐渐增加,至21天达到33.6%,与MCCs组比较无明显差异(P>0.05);对照组下层细胞平均阳性染色面积仅为1.4%,与MCCs组和诱导组比较有明显差异(P<0.05)。结论:1.通过两次酶消化法可以获得高质量的MCCs。2.应用Transwell共培养体系可以诱导HAMSCs向MCCs分化。3.应用Transwell共培养体系诱导HAMSCs向软骨样细胞的最佳共培养时间为21d。