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口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease viruse,FMDV)引起偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的头号烈性传染病,我国将其列为Ⅰ类动物传染病。作为畜牧业大国之一,我国每年饲养猪、牛、羊等多达18亿头。口蹄疫的爆发和流行对我国养殖业造成了严重危害。目前,FMDV感染的致病机制仍未完全揭示。FMDV作为一种专性活细胞内寄生的生物,在FMDV复制复合物形成的过程中,病毒蛋白与宿主蛋白发生广泛的相互作用。前期我们利用免疫共沉淀技术,发现FMDV的非结构蛋白3A可以与宿主波形蛋白(Vimentin)相互作用,为研究其作用机制进行了以下研究:1、利用GST-pull down和激光共聚焦共定位的方法确定FMDV 3A与vimentin之间的相互作用。为了进一步确定3A与vimentin互作的关键氨基酸位点,研究表明该FMDV 3A存在多个氨基酸位点与vimentin相互作用,将FMDV 3A蛋白进行丙氨酸突变扫描,通过GST-pull down的方法进行鉴定,结果表明FMDV 3A蛋白上第15-21位氨基酸是与vimentin互作的关键氨基酸。这说明FMDV 3A与vimentin相互作用的位点位于FMDV 3A蛋白的N端。2、本研究将FMDV感染后不同时间点的细胞分别进行免疫荧光实验Westernblotting和Real time PCR分析。免疫荧光实验结果表明:FMDV感染PK-15细胞可导致vimentin在细胞内的分布发生变化,正常细胞中vimentin均匀分布在细胞质中,随着病毒感染时间的延长(3 h-4 h),vimentin聚集在细胞核一侧,在病毒感染后5 h,vimentin呈“笼子”结构聚集在细胞核周围,且FMDV感染细胞1 h-5 h,3A与vimentin始终共定位。Westernblotting和Real time PCR结果表明:在FMDV感染初期,宿主vimentin蛋白表达水平和mRNA转录水平有短暂的下降,随着FMDV感染时间的延长,宿主vimentin蛋白表达水平和mRNA转录水平逐渐升高,但在FMDV感染的过程中,宿主vimentin蛋白没有被切割。这说明FMDV感染导致宿主vimentin发生重排,且vimentin发生重排不是由于vimentin被切割导致。在FMDV感染过程中,vimentin这种先下降后升高的表达方式与FMDV感染后与宿主之间复杂的相互作用有关,vimentin蛋白可能参与FMDV感染的多个过程,而且在不同的过程中发挥着不同的作用,从而使得vimentin蛋白表达相应地在不同时间出现差异。3、将外源表达的vimentin进行纯化复性,并利用vimentin蛋白阻断PRRSV侵染Marc-145细胞,以验证复性后vimentin具有生物活性,再将其与FMDV感作2 h后侵染细胞,利用Real time PCR(绝对定量)检测病毒感染12 h后细胞内病毒拷贝数,发现vimentin并没有对FMDV感染造成影响。随后又通过细胞流式法确定vimentin仅分布于细胞质基质中,而不存在于细胞外膜表面。表明vimentin在FMDV的吸附和进入细胞的过程中不发挥作用。综上,这些实验结果证明vimentin在FMDV吸附和侵入细胞的过程中不发挥作用,但在FMDV感染过程中可与FMDV 3A蛋白相互作用,为深入阐明FMDV感染致病机制提供重要信息,为预防和控制FMDV感染提供新思路。