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经遗传改良后的转基因鱼具有生长速度快、饵料转化效率高、抗冻耐寒、抗病能力强等优良性状,但是,迄今尚无一例作为食品的转基因鱼释放到自然水体中进行商品化养殖,其原因之一在于对转基因鱼可能的生态风险的担忧。全面衡量和评估转基因鱼的生态风险是其商业化进程中的重要一环。水产养殖中,研究最多的环境因子有温度、溶氧、氨氮和亚硝酸氮,这些因子是影响集约化养殖的主要环境因子,特别是溶氧和氨氮。目前,有大量的研究表明,低氧和氨氮影响鱼类摄食、生长、发育和生殖等。研究转生长激素基因鲤鱼的溶氧需求、低氧耐受能力和氨氮耐受特性等生理特性,是评价转基因鱼生存力与竞争力的重要参数之一。
本论文主要围绕低氧和氨氮这2个重要的环境因子展开研究,首先,研究了低溶氧和氨氮胁迫对转生长激素基因鲤鱼的生理生态的影响和转基因鱼的代谢特性;其次,以斑马鱼为模型,通过转植VHb基因,研究了转VHb基因斑马鱼对低溶氧和氨氮胁迫的耐受特性;最后,利用基因芯片技术研究了高氨胁迫下斑马鱼脑组织的基因表达谱。本论文的主要研究结果如下:
(1)比较研究了转生长激素基因鲤和对照鲤的呼吸代谢,发现转植外源生长激素基因没有改变受体鲤鱼的基础代谢特性。摄食后0-96h内,转基因鱼的平均耗氧率是对照鱼的的1.32倍,存在显著性差异;饥饿96h以后,96h至144h内转基因鱼和对照鱼的平均耗氧率无显著性差异。进一步研究转基因鱼与对照鱼饥饿和摄食后的窒息点,发现两者之间在饥饿条件下窒息点无显著性差异,而摄食后转基因鱼的窒息点高于对照鱼窒息点。
(2)通过分析长期饥饿条件下转基因鱼的身体组分和能量的变化,研究转基因鱼的饥饿应答特点,发现两者之间干重变化及能量消耗变化无显著性差异。进一步确证外源生长激素基因没有改变鲤鱼的基础代谢,并在一定程度上揭示了转基因鱼对饥饿的耐受特征。
(3)发现转基因鲤鱼对氨毒胁迫比姊妹群对照鱼更敏感,转基因鲤鱼在氨氮耐受能力方面比对照鱼差。在96小时的急性毒性试验中,虽然氨氮96小时半数致死浓度(LC50)在转基因鱼和姊妹群对照鱼之间没有显著性差异,但是,转基因鱼的平均生存时间比对照鱼短,且存在显著性差异。在0.117mgN/L、0.481mgN/L和0.905mgN/L的氨氮胁迫条件下经过21天氨氮慢性实验,发现不同浓度的氨氮胁迫下,转基因鱼的特定生长率随着氨氮浓度提高显著性下降;而对照鱼的特定生长率只在氨氮浓度0.905mgN/L才表现出显著性下降。同时也比较了非离子态氨氮慢性胁迫条件下两者的死亡率,发现转基因鱼比对照鱼死亡率高。在24h急性氨氮胁迫条件下转基因鱼的耗氧率随着氨氮浓度提高表现出显著性提高,但是,对照鱼的耗氧率随着氨氮浓度提高变化不显著。
(4)构建以鲤鱼β-actin启动子驱动的透明颤菌血红蛋白基因(VHb)的表达载体pCVCG,研制获得转VHb基因斑马鱼家系。低溶氧胁迫研究发现,在2.5%O2(0.91mg/l)条件下经过156h的低氧胁迫后,7日龄的F2代转VHb斑马鱼的生存率明显高于姊妹群对照鱼。同时,研究低氧胁迫下实验鱼的一些低氧应答的标志基因表达情况,这些基因的表达水平也成规律性变化,结果表明VHb可能有助于削弱低氧胁迫对斑马鱼的影响,进一步证实VHb能部分提高斑马鱼的低氧耐受能力。此外,8日龄F2代转基因鱼及其对照鱼的48h急性氨氮毒性胁迫实验发现,转基因鱼的半数致死浓度(LC50)高于对照鱼,结果表明转VHb基因斑马鱼增强了对氨氮胁迫的耐受能力。因此,通过转VHb基因有望研制具有耐受低溶氧和高氨胁迫的养殖鱼类新品种。
(5)用斑马鱼基因芯片(包含45220个基因/探针)检测了非离子氨浓度2.79±0.17mgN/L胁迫7天后斑马鱼脑组织的基因表达谱,发现3个生物学重复之间共有的显著性差异基因为1367个,其中上调表达的基因为1072个,下调表达的基因为295个。用网路工具GOstat和KOBAS对这些显著性差异基因进行基因功能注释和信号通路验证,统计方法为费舍尔的精确检验(FishersExactTest),这些差异表达基因经过GO富集和信号通路(pathway)富集,具有代表性的功能聚类主要集中在有关氮化合物代谢、碳水化合物代谢、凋亡、胁迫应答、对非特异免疫应答、半胱氨酸型肽酶和与神经发育几个方面。