结核病(Tuberculosis)是一种古老的人畜共患传染病，主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起，少部分是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)导致。结核分枝杆菌与牛分枝杆菌同属于结核分枝杆菌复合物，但具有不同的寄主范围、毒力和生理特性。本研究对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的基因组进行比较分析，获得它们之间的遗传差异，为洞察这两种菌的进化和开发新的诊断方法提供理论依据；然后建立这两种菌株快速鉴别的PCR方法及新型可视化LAMP检测方法，为结核病的快速诊断提供新的方法；最后探讨了结核分枝杆菌与部分非结核分枝杆菌临床分离株整合子的携带情况，为研究分枝杆菌新的耐药机制提供信息。 结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌AF2122/97的全基因组序列比对分析发现，这两种菌株基因组序列的相似度>99.95％，牛分枝杆菌相对结核分枝杆菌存在14处大片段缺失(0.8—12.7kb)和6处基因内部小片段缺失(12—714bp)，其中3处大片段缺失(RD18、RD19、RD20)及2处基因内部缺失(Mb1319、Mb3293c)为首次报道；结核分枝杆菌相对牛分枝杆菌存在6处大片段缺失(1.3—5.4kb)和5处小片段缺失(10-48bp)，基因内部缺失都为首次报道。缺失导致牛分枝杆菌基因组比结核分枝杆菌小。大多数缺失基因编码细胞壁组成成分、分泌蛋白以及代谢酶类等，表明这些基因的缺失可能对于结核杆菌与寄主相互作用及免疫逃逸起到了重要的作用。 根据基因组比对分析结果，针对牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的三处差异缺失区域(153bp，RD10和TbD1)设计引物，分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌快速鉴别检测的PCR方法，并对81株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其它常见菌株进行了检测。结果显示，针对153pb缺失片段设计的普通PCR分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出654bp及492bp目的条带；针对RD10和TbD1设计的多重PCR分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478bp及361bp目的条带、358bp及524bp目的条带；两种PCR检测方法的准确率和特异性均为100％。敏感性试验显示这些PCR检测方法可扩增基因组DNA的极限均为10pg。结果表明，针对这三处缺失建立的PCR检测方法具有非常快速、简单及有效的特点，可以应用于牛源或者人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的鉴别检测。 除了PCR检测方法外，本研究还基于rimM(编码16S rRNA—加工蛋白)基因建立了一种新型的可视化环等温扩增(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)方法，用于快速检测结核分枝杆菌及牛分枝杆菌。这种新型的可视化LAMP在反应体系中加入了钙黄绿素指示剂与氯化锰，65℃反应1h即可通过目测产物颜色而判断结果。反应模板中不含靶DNA的LAMP产物仍旧保持橙色，而具有靶DNA的LAMP产物则变为绿色。使用该方法对84株结核分枝杆菌及3株牛分枝杆菌进行检测均显示阳性结果，而在51株非结核分枝杆菌及9种其它常见菌株中均显示阴性结果，准确率和特异性均为100％。敏感性试验显示，该方法扩增基因组DNA的极限为1pg。扩增产物电泳图谱及HhaⅠ酶切分析验证了LAMP产物的特异性。这种新型可视化LAMP不但可以对细菌培养物进行检测，而且还能对痰液、血液、胸水等临床样品进行检测。研究表明，可视化LAMP具有快速、特异、敏感、无需昂贵仪器及结果可视化等优点，在临床检测结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中具有巨大的潜力。 最后，为了探索分枝杆菌新的耐药机制，我们还对结核分枝杆菌及非结核分枝杆分枝杆菌临床分离株进行了Ⅰ型及Ⅱ型整合子的扩增检测。结果在10株结核分枝杆菌及3株鸟胞分枝杆菌的DNA模板中扩增出了Ⅰ型整合子，但在所有菌株中均没有扩增出Ⅱ型整合子。13株Ⅰ型整合子阳性菌株可变区的基因盒都为arr—3—aacA4，编码对利福平和氨基糖苷类抗生素的耐药基因。采用绝对浓度法对这13株分枝杆菌进行药敏试验发现，Ⅰ型整合子的存在与这些菌株的耐药具有一定的相关性。通过染色体步移法对Ⅰ型整合子进行了定位分析发现，这种Ⅰ型整合子并没有整合到结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌的基因组中，而可能整合于质粒中，整合酶的侧翼序列与越南伯克霍尔德氏菌G4质粒(pBVIE02)及豚鼠气单胞菌质粒(pFBAOT6)中的序列具有最高相似性(99％)。至于这些分枝杆菌是否携带这些质粒需要进一步的验证。