论文部分内容阅读
研究背景脑性瘫痪(Cerebral Palsy,CP),简称脑瘫,是一种出生前后1个月内由各种危险因素引起的非进行性、永久性神经发育障碍综合征,是儿童致残的主要原因。每1000名新生儿中有3.3名患病儿童,且随着儿童年龄增长,某些症状会更加明显。到目前为止,没有治愈脑瘫的手段,但是支持性治疗、药物治疗等方法可以在一定程度上缓解脑瘫症状,提高患者运动能力和生存生活能力。关于脑瘫的基础机制研究从未减少,临床研究证实缺血缺氧脑损伤是造成脑瘫的主要原因。由此诱发的脑室周围白质软化症(Periventricular leukomalacia,PVL)表现为少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cell,OPC)成熟和分化停滞致使髓鞘损伤、神经传导中断。因此通过干预措施改善脑瘫患儿脑内神经发育环境,促进OPC的分化和成熟使髓鞘再生成为近几年来的脑瘫研究热点。低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)是缺氧转录反应的重要组成部分。缺血缺氧条件下,OPC对大脑内血液中的氧浓度的减少十分敏感,HIF-1α亚型在细胞中高表达,与HIF-1 β一同转移至胞核中调控与细胞存活相关途径的基因转录,以刺激脑组织和细胞对缺氧损伤的适应。除此之外,HIF-1α还可诱导激活多种代谢酶和转运蛋白的表达。葡萄糖是大脑能量代谢的主要来源,但不能自由穿过细胞膜,需要葡萄糖转运蛋白(Glucosetransporters,GLUTs)跨膜转运为神经细胞提供氧和营养物质。已有研究发现HIF-1α在缺血缺氧时可能诱导GLUTs上游基因家族SLC2A编码存在于中枢神经系统(Central nerve system,CNS)内皮细胞、星形胶质细胞中的GLUT亚型1和神经元中的亚型3,诱导脑内糖酵解加速代偿,优化能量产出。但是关于HIF-1 α对OPC的促进作用和对GLUTs的调控作用,两者之间是否存在联系尚不明确。根据以上我们提出假设,HIF-1α可能通过诱导GLUT1和GLUT3的表达促进CP后OPC分化、髓鞘再生;抑制HIF-1α后,GLUT1和GLUT3表达下调可能无法促进脑内白质损伤修复。研究目的此次实验通过建立缺血缺氧结合感染的联合型CP模型小鼠来模拟CP的临床症状和神经系统变化。运用奥替普拉(Oltipraz)抑制HIF-1α蛋白表达探索CP小鼠脑内OPC分化、OL成熟、髓鞘再生与GLUTs之间的关系及作用原理,在从缺氧适应方面为今后的课题研究和临床治疗提供可行的思路。研究方法(1)脑瘫模型建立及抑制干预处理新生幼鼠出生后第7天在冰上对其进行深度麻醉。固定四肢使小鼠颈部过伸,在前颈部中线腹侧做一个切口,体视显微镜下找到右侧颈总动脉,阻断颈内动脉血流。结扎后1小时,将幼鼠暴露在8.0%O2和92%N2混合的缺氧箱中90分钟。最后根据体重对幼鼠腹腔注射脂多糖3-5μL(Lipopolysaccharides,LPS,1 mg/Kg)。将小鼠共随机分为六组:(a)sham组;(b)CP组;(c)CP+Vehicle组;(b)CP+低剂量组(35 mg/Kg);(c)CP+中等剂量组(75 mg/Kg);(d)CP+高剂量组(150mg/Kg),在模型建立后12h内选择新生鼠腹腔注射HIF-1α抑制剂Oltipraz最低可耐受量0.2ml。(2)行为学检测水平网格测试将出生后30天(Postnatal day 30,PND30)小鼠放在四周封闭的金属网格上,待小鼠紧紧抓住网格后,将网格缓慢翻转过来。记录小鼠从翻转开始到从铁丝网上掉落的时间记作潜伏期,检测CP小鼠的抓握能力。爬杆测试选择一根下端固定有球的木杆。以小球为起点,将PND35小鼠放在球上,翻转木杆使小球朝上,记录小鼠头朝下开始,从有球端爬到地面所需的时间检测小鼠动作协调性,并记录3项指标:(a)从有球端到中点这段长度所需时间;(b)爬杆中点到地面的时间;(c)小鼠爬过整个杆的时间。得分标准:3秒内完成上述动作之一得3分;6秒钟得2分;超过6秒得1分。(3)通过免疫荧光技术观察小鼠脑内髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)、成熟少突胶质细胞(CC1)和少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte transcription factor2,Olig2)的表达变化,评估白质损伤水平。(4)利用Western blot技术检测不同脑区和不同分组HIF-1α、GLUT1和GLUT3蛋白表达水平。研究结果(1)建立CP模型小鼠后21天解剖显示结扎侧大脑半球大面积液化缺损,H&E染色结果显示小鼠脑组织细胞肿胀,伴有炎性浸润和细胞死亡。(2)建立CP模型小鼠后21天抓握力下降(P<0.05)伴有肢体不协调(p<0.05)。(3)PND14和PND21CP小鼠脑组织中MBP密度下降,不同脑区CC1表达量减少(P<0.05),表明髓鞘减少、OL数量下降和OPC分化阻滞。(4)PND14的CP小鼠在皮质、海马和基底节中HIF-1α表达升高(p<0.05),PND21、PND28的CP小鼠表达下降与sham组表达量基本一致,GLUT1和GLUT3(p<0.05)表达增加,表明PND14可能是CP变化的临界点。(5)WB结果显示奥替普拉抑制HIF-1α后,PND14的MBP和GLUT1、GLUT3表达减少(p<0.05)。研究结论(1)CP后神经系统内髓鞘密度和OLs数量减少,导致OPC分化成熟障碍,白质受损。(2)抑制HIF-1α使葡萄糖供能速率下降,白质受损加重。因此HIF-1α调控CP模型小鼠脑内的GLUT1和GLUT3表达并参与髓鞘再生和白质损伤修复,可能对大脑具有神经保护作用。