近年来，非法添加物成为食品安全问题之一。碱性橙、碱性嫩黄属于工业染料，严禁用于食品中。但由于其染色不易褪色，成本低廉，因此时有不法商贩将其滥用于豆制品、水产品等食品。雌二醇、雌酮属于内源性性激素，其通过食物链进入人体内积累，当超出正常水平会破坏机体正常生理平衡。由于雌激素能提高禽畜的产肉量、产奶量而可能被违禁用于动物生产。目前对于非法添加物的检测方法主要为仪器分析法，成本高，通量低，前处理繁琐，不能完全满足实际检测需求。免疫分析法，尤其酶联免疫吸附法(ELISA)，逐渐作为一种快速、廉价的高通量筛选检测手段，在食品安全检测中表现出越来越重要的作用。针对此，开展4种非法添加物质的ELISA方法研究，主要内容如下：　　 1.碱性橙icELISA。利用前期获取的碱性橙多克隆抗体，筛选出抗体和包被抗原的最佳工作浓度，优化了反应时间等检测条件，建立了碱性橙间接竞争ELISA方法(icELISA)，半抑制浓度IC50为1.4ng/mL，检测限(LOD)为0.1ng/mL，线性范围为0.2～9.9ng/mL；对豆干添加样进行icELISA检测，批内回收率达到了75.7％～117.6%，日内和日间变异系数分别小于5%和25%；进一步比较了所建立icELISA法和HPLC法的相关性，相关系数达到了0.98。说明了所建立的icELISA法用于豆干制品碱性橙检测的可靠性比较好。　　 2.碱性嫩黄icELISA。针对碱性嫩黄对称的结构特点，在亚氨基位置上连接一个6碳原子的含羧基手臂，质谱鉴定后，采用水溶性碳二亚胺(EDC)法将所获碱性嫩黄半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原和包被原，经紫外扫描法进行鉴定偶联成功；用所合成的免疫原免疫新西兰兔，制备碱性嫩黄多克隆抗体，通过间接ELISA评价抗体的质量。结果表明抗体效价可达到100000，可识别偶合态碱性嫩黄，但对游离碱性嫩黄的检测灵敏度较差，目前尚不能直接应用。　　 3.雌二醇icELISA。在雌二醇苯环的羟基上连接一个含羧酸的2碳手臂，制备雌二醇半抗原；通过核磁共振氢谱和红外光谱确证了半抗原结构；随后采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联，制备免疫原和包被原，紫外光谱法鉴定偶联成功。免疫新西兰兔，制备出多克隆抗体；优化反应体系的缓冲液种类、反应时间、抗原包被浓度、血清稀释倍数等理化因素，建立了雌二醇icELISA方法，LOD为0.3ng/mL，线性范围为0.8～22.4ng/mL，IC50为3.9ng/mL；并与8种结构类似物的交叉反应率均小于1.21%，表明抗体的高特异性。　　 4.雌酮icELISA。针对雌酮结构特点，也在其苯环的羟基上连上一个含羧酸的2碳手臂制备出半抗原，采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联，制备免疫原和包被原，免疫新西兰兔制备出多克隆抗体；优化反应时间、抗原包被浓度、血清稀释倍数、缓冲液种类等理化因素，建立了icELISA方法，LOD为125pg/mL，线性范围为0.3～14.1ng/mL，半抑制浓度为2.0ng/mL。除与雌二醇的交叉反应率达到了80%以上，与7种结构类似物的交叉反应率均小于0.51%。　　 本文为食品中非法添加物染料碱性橙、碱性嫩黄以及非法添加兽药雌二醇、雌酮快速酶联检测试剂盒开发奠定了基础。