磷是植物生长发育所必须的营养元素之一。土壤中的磷主要是难溶磷,植物不能直接吸收利用,所以植物经常面临低磷胁迫。根际酸化是指植物通过根系分泌质子和有机酸引起根际周围土壤酸化,根际酸化可促进土壤难溶磷的溶解,从而提高植物对土壤磷营养的利用率,因此,根际酸化是适应低磷胁迫的一种方式。但是,植物感知低磷信号并调控根际酸化反应的分子机制还不清楚。课题前期研究中,通过溴甲酚紫颜色指示剂显色方法,筛选到一株低磷诱导根际酸化增强的拟南芥突变体p455。低磷胁迫条件下,p455突变体根际酸化增强,叶中花青素积累变少,对难溶磷的耐受性增强。序列分析表明,P455基因编码一种钙调素结合蛋白,属于IQD蛋白家族。进一步实验结果表明,P455定位于胞质微管骨架上,负调控低磷诱导的根际酸化反应。但是其具体的分子机制还不清楚。为了分析P455蛋白在低磷诱导的拟南芥根际酸化反应中的作用,本实验首先利用全内反射荧光显微镜,观察p455::GFP融合转基因拟南芥植株的GFP荧光变化,分析在低磷条件下P455蛋白的细胞定位特性。结果表明,p455::GFP定位在细胞质微管上,但与对照相比,低磷胁迫处理可影响微管定位的p455::GFP荧光的分布,低磷胁迫三天可导致丝状分布荧光的数量减少、长度变短;而TUA5::RFP融合转基因植株的RFP荧光观察表明,低磷胁迫并不影响微管自身的结构。蛋白免疫分析表明,低磷处理导致P455蛋白泛素化降解。因此推测,低磷胁迫可影响P455蛋白微管定位,并导致其被泛素化降解。酵母双杂交及双分子荧光互补实验结果表明,微管定位的P455蛋白不与微管蛋白TUA3和TUA6直接互作,但可与微管蛋白TUA6结合的驱动蛋白KLCR1/KLCR2直接相互作用。推测,P455可能通过KLCR1/KLCR2介导定位于微管上。根际酸化实验结果表明,低磷胁迫条件下,驱动蛋白突变体klcr1和双突p455 klcr1的根际酸化能力比WT和p455强,表明KLCR1可能是P455蛋白下游信号通路的主要组分。免疫共沉淀和质谱分析相结合实验结果表明,膜质子泵蛋白AHA1、膜泡转运相关蛋白PATL1和PCAP1等可能与P455存在相互作用;酵母双杂交及双分子荧光互补实验并未检测到以上蛋白于P455直接的相互作用,却发现这些蛋白可与P455结合蛋白KLCR1/KLCR2直接的相互作用。推测,P455可能通过KLCR1/KLCR2介导与AHA1、PATL1、PCAP1互作。低磷胁迫条件下,质膜质子泵突变体aha1根际酸化能力比WT弱,且双突p455 aha1的根际酸化能力弱于p455。这些结果表明AHA1可能是P455和KLCR1蛋白下游信号通路的组分,介导低磷信号,调控H+-ATPase。但是,AHA1如何影响p455的根际酸化有待进一步研究。另外,有文献报道Ser/Thr蛋白激酶PKS5可以使质膜蛋白AHA2的Ser-931磷酸化,负调控PM H+-ATPase。因此,我们猜想PKS5可能与P455有互作。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证实到PKS5与KLCR1/KLCR2有直接的相互作用,以上结果表明P455可能是通过KLCR1/KLCR2与其他蛋白间接互作发挥功能。