氨基酸作为一种手性化合物广泛应用于医疗、食品、保健品及饲料等与人类生活和健康密切相关的几大行业。氨基酸的生产方法主要有发酵法、化学合成法和生物酶法。酶法合成与化学合成相比,具有高效、环保、安全和适合大规模生产等优点。本论文旨在研究生物酶法制备手性氨基酸,主要做了以下两方面的工作:第一部分工作利用基因工程技术在原核表达系统中分别重组表达了 L-酰胺酶(L-amd)和酰胺消旋酶(ACLR),并对酶法催化合成L-2-氨基丁酸和L-苯丙氨酸进行了探索。1.在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达了 L-酰胺酶,通过超生破碎、过镍亲和柱等步骤,得到了纯化后的酰胺酶。利用牛血清白蛋白(BSA)做标准曲计算酶蛋白浓度为5.67μg/ml。酶学性质研究确定最佳转化条件为:温度42℃,pH=8.0,表面活性剂对酶活无明显影响,最佳底物浓度为0.1 mol/L。金属离子会不同程度的影响酶活,在离子浓度高于1×10-3mol/L时,Ca2+、Cu2+、Co2+、Mg2+、Mn2+和Zn2+六种离子均对L-amd有不同程度的抑制作用;当离子浓度小于1×10-3 mol/L时,这六种离子对酶活影响不大。此外,该酶具有广泛的底物特异性,对L-脯氨酰胺和L-苯丙酰胺的活性较高。2.将L-酰胺酶与酰胺消旋酶组合使用对DL-苯丙酰胺进行转化制备L-苯丙氨酸,优化了酶促反应条件,双酶体系的最佳工艺条件为:反应温度42℃,pH=8,底物浓度300 mmol/L,双酶比例为1:1,反应12 h,在此条件下共得到L-苯丙氨酸40.7 g,产率为80.8%。该工艺简化了反应步骤,提高了底物的利用效率,对L-苯丙氨酸工业化生产有重要参考意义。第二部分工作为利用定向进化的天冬氨酸转氨酶催化合成3,4-二甲氧基苯丙氨酸。天冬氨酸转氨酶是一类广泛存在于生物细胞内的转氨酶,在氮代谢中起重要的作用,它可催化左旋多巴的前体化合物3,4-二甲氧基苯丙氨酸的合成,但野生型的天冬氨酸转氨酶对3,4-二甲氧基苯丙酮酸的催化活性较低,需要通过基因工程手段对酶分子结构进行改造,以提高其催化活力。1.首先摸索了易错PCR方法构建突变库的最佳条件,即PCR循环50次,Mn2+加入量为1 μL,且不进行连续易错PCR。在此条件下进行易错PCR构建了3000多个单克隆,通过催化3,4-二甲氧基苯丙酮酸和L-天冬氨酸反应进行初步的筛选,得到了约500个阳性突变体。经基因测序与HPLC检测活性,得到了5个活性较好且稳定的突变酶,即10b,170a,261b,369c,478c。其中170a的催化活性最高。利用分子对接软件对突变酶170a分子结构模拟分析,170a的316位Arg(精氨酸)突变为His(组氨酸),3,4-二甲氧基苯丙酮酸中苯环和Arg361形成了以氢键为主,弱的π-π共轭为辅的结合方式。当Arg突变成His后,组氨酸上的咪唑基与苯环也能形成π-π共轭,由于咪唑环是芳香族杂环故其形成的共轭稳定性强于苯环和Arg361形成的,故增强了这些残基和底物的相互作用,使得170a活性得以提高。2.优化优势突变体170a的转化条件。经考察表明其最佳转化条件为:温度40℃,pH=8,表面活性剂种类Triton X-100,含量0.2%,最佳底物浓度100 mmol/L,n(3,4-二甲氧基苯丙酮酸):n(L-天冬氨酸)=1:1。在此条件下170a对底物3,4-二甲氧基苯丙酮酸的转化率高达91.6%,而野生型天冬氨酸转氨酶的催化率仅为68%。利用发酵罐对170a扩大发酵,转化3,4-二甲氧基苯丙酮酸并分离出产物L-3,4-二甲氧基苯丙氨酸1773.36 g,产率为87.4%。