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背景头颈部鳞状细胞癌（头颈鳞癌）是全球最常见的癌症类型之一,其发病部位特殊、类型复杂多样。由于认知不足,大多数患者在确诊时已经进入中晚期阶段,其中超半数的患者又会出现复发或远端转移的情况,导致该病五年生存率不足40%。近年来免疫疗法被认为是治疗晚期或侵袭性癌症最有前景的手段,目前已成为头颈鳞癌的一线用药。免疫检查点阻断剂是免疫疗法的重要组成部分,其中最具代表性的是PD-1/PD-L1阻断剂,其作用机制是通过阻断免疫检查点分子活性,释放肿瘤微环境中的免疫刹车,重新激活T细胞对肿瘤的杀伤作用,达到抗肿瘤的治疗效果。虽然以PD-1阻断剂为代表的免疫疗法可以显著改善头颈鳞癌患者的治疗效果,但由于无法确定潜在获益人群,在未经挑选的癌症患者中其总的客观应答率仅为20%左右,这也可能与部分患者存在抑制性免疫微环境有关。因此,有必要建立一个可以预测头颈鳞癌患者预后及免疫疗法临床疗效的基因标签,以富集免疫疗法获益人群。另外,筛选可以改善患者免疫状态的活性成分作为联合免疫治疗药物,将有助于进一步提高客观应答率。推动精准治疗已成为癌症治疗的发展方向,利用生物大数据进行基因信息的挖掘研究是其重要手段。随着精准医学的兴起,基于基因标签的药物发现在联合治疗药物筛选中展现了良好的应用潜力。人参是具有免疫调节作用的代表性中药,其主要活性成分人参皂苷具有抗肿瘤和调节免疫的双重作用。大量研究表明人参皂苷可以通过刺激淋巴细胞增殖、调节免疫细胞功能和免疫球蛋白产生等多种途径调节肿瘤免疫微环境,从而增强抗肿瘤效果。因此,可以借助基因标签从人参皂苷中筛选出潜在活性成分,其与免疫检查点阻断剂联用的可能性值得深入探究。目的针对免疫疗法在头颈鳞癌治疗中客观应答率低的问题,本研究旨在构建可以预测头颈鳞癌患者预后及免疫疗法疗效的基因标签,并筛选可以逆转该基因标签的人参皂苷活性成分,以及通过实验确认候选化合物与PD-1阻断剂联用对头颈鳞癌治疗具有协同增效作用。方法1.基于头颈鳞癌患者的转录组数据和临床信息,采用LASSO回归算法构建最优基因标签。在多个数据集中,通过K-M生存曲线和时间依赖性ROC曲线评估其预测患者预后的能力。通过单变量和多变量Cox回归分析,评估其与临床病理因素和总生存期之间的相关性,并构建列线图。此外,评估该基因标签与免疫细胞浸润、抗癌免疫反应状态及免疫疗法反应等之间的相关性。2.通过细胞毒性实验探究多种人参皂苷单体对头颈鳞癌和其他肿瘤细胞增殖的影响,并探究这些单体成分对免疫细胞活性的影响。基于之前建立的基因标签,采用RT-qPCR实验筛选出可以逆转该基因标签的候选人参皂苷单体。3.通过实时动态成像系统、淋巴细胞转化实验、PBMC与肿瘤细胞的共培养体系探究候选人参皂苷单体对免疫细胞杀伤肿瘤细胞能力的影响。通过免疫细胞亚群检测探究候选人参皂苷单体对多种免疫细胞亚群比例的影响。此外,构建荷瘤小鼠模型,通过瘤重和瘤体积监测、肿瘤浸润淋巴细胞检测等探究其与抗PD-1抗体联合使用对肿瘤生长和肿瘤免疫微环境的影响。4.通过Pearson相关性分析和基因集富集分析评估候选人参皂苷单体影响的基因标签相关基因与PD-1之间的相关性。通过流式细胞术和Western Blot实验探究候选人参皂苷单体对淋巴细胞PD-1表达水平的影响。最后,通过分子对接和分子动力学模拟评估候选人参皂苷单体与PD-1的结合情况。结果1.本研究构建了由13个免疫相关基因组成的基因标签,该基因标签在多个数据集中均具有预测头颈鳞癌患者预后的良好潜力,并且可以作为一个独立的预后因子。基于该基因标签和多个临床病理因素构建的列线图,可以用于临床上量化头颈鳞癌患者个体的生存可能性。该基因标签与多种免疫细胞浸润水平有关,可以较好地反映肿瘤免疫微环境的状态,并在预测免疫治疗应答方面具有良好的潜力。2.人参皂苷具有广谱的抗肿瘤作用,人参皂苷Rg3、Rh2和CK对五种肿瘤细胞均具有显著的抑制作用,其中对人舌鳞癌Cal-27细胞的抑制作用最为显著。同等药物浓度下,人参皂苷单体对免疫细胞的活性没有损伤。此外,由于人参皂苷Rh2是Rg3的主要代谢产物,两者药理作用相似,但人参皂苷Rh2在逆转基因标签相关基因表达方面最具潜力。3.人参皂苷Rh2和抗PD-1抗体联合使用可以显著增强PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用,还可以增加外周血中NK细胞和CD8+T细胞数量。在荷瘤小鼠模型中,人参皂苷Rh2可以显著促进抗PD-1抗体对头颈鳞癌的抑制作用,表明两者具有协同增效作用。两药联用可以改善脾脏肿大和胸腺萎缩的状态,增加脾脏中T细胞比例和B细胞激活比例,并显著增加肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润丰度及B细胞激活比例,从而增强抗肿瘤免疫反应。4.人参皂苷Rh2所影响的基因标签相关基因与PD-1呈显著正相关,且参与调节PD-1阻断癌症免疫治疗通路。人参皂苷Rh2可以直接下调PBMC表面PD-1的表达,并可以稳定结合PD-1蛋白。以上结果说明,人参皂苷Rh2可能是通过下调PD-1蛋白水平来抑制PD-1信号通路,从而与抗PD-1抗体产生协同作用。结论本研究建立了一个稳健的可以预测头颈鳞癌患者预后及免疫疗法反应的基因标签,该基因标签有助于在临床预测患者的生存可能性及富集免疫疗法获益人群。同时,基于该基因标签筛选得到了潜在的联合免疫治疗候选化合物,其中人参皂苷Rh2可以促进淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,并增强抗PD-1抗体对头颈鳞癌的抑制效果,其机制可能与结合并抑制PD-1蛋白水平有关。该联合疗法具有重要的临床应用价值,此研究策略将为从中药中发现联合免疫治疗药物提供新的思路。