木质纤维素是地球上含量最为丰富的碳水化合物之一,丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物类别,而里氏木霉(Trichodderma reesei)是其中的典型代表。在纤维素等底物存在的条件下,里氏木霉能表达分泌大量的纤维素酶以实现对纤维素的高效降解,因此成为纤维素酶工业的主要生产菌株。目前对里氏木霉纤维素酶表达合成的研究主要集中在两个方面:一方面集中在纤维素酶基因的表达调控方面,以期从理论上阐释产酶调控机制,从而为通过菌株的遗传改造提升纤维素酶的表达水平提供理论支持;另一方面,通过对里氏木霉现有酶系组分的性能改善或合理复配以提高其酶解效率。在纤维素酶基因表达调控方面,目前已经鉴定到了多个直接参与酶基因表达的转录因子包括正调控因子及负调控因子。研究发现,不同的转录因子在启动子上具有各自特定的结合位点及生物学功能,这意味着纤维素酶基因的诱导转录是一个多转录因子参与,从而响应不同环境信号的复杂过程。为了更为深入地了解这一复杂过程,有必要筛选鉴定纤维素酶基因表达过程中涉及的其他未知转录因子及辅功能因子,从而解析里氏木霉纤维素酶基因的转录调控网络。此外,作为真菌的里氏木霉,其染色质结构的变化包括重构和核小体共价修饰可能也是纤维素酶基因诱导表达过程中的重要影响因素,系统阐述此种变化在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用对全面理解相关调控机制也极为重要。因此,论文工作主要从上述几个方面展开,取得相应结果如下:一、鉴定了一个新的纤维素酶基因转录抑制因子Rce1,其通过与Xyr1在纤维素酶基因启动子上竞争性结合参与纤维素酶基因的表达调控以里氏木霉主要的纤维素酶基因启动子(Pcbh1)为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中筛选获得了真菌典型转录因子Ga14类型的转录因子Rce1。细胞定位分析发现Rce1主要位于细胞核。对rce1的缺失及过表达分析表明,Rce1在纤维素酶表达过程中发挥抑制作用。通过体外的凝胶泳动迁移(EMSA)及DNA足迹保护(DNAse Ifootprinting)实验鉴定了Rce1在cbh1启动子上的结合位点,发现其与纤维素酶基因的关键转录激活因子Xyr1具有相似的结合位点。进一步通过体外竞争及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分析发现,Rce1在纤维素诱导表达过程中与Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子,进而实现对纤维素酶表达的抑制作用,而xyr1过表达可以解除rce1对纤维素酶的表达抑制。综上所述,我们通过酵母单杂交筛选到一个转录抑制因子Rce1,通过与转录激活因子Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子来调控纤维素酶的表达。二、发现泛素结合酶TrUbc4在里氏木霉纤维素酶表达过程中发挥重要作用以纤维素酶基因启动子cbh1为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中还筛选获得了一个属于UBC超家族的泛素结合酶TrUbc4。细胞定位分析发现TrUbc4定位于细胞核。TrUbc4编码基因的敲除显著降低了里氏木霉纤维素酶基因的诱导转录和表达。突变体回补实验发现,TrUbc4的活性位点C85在纤维素酶表达过程中发挥着重要作用。在Xyr1过表达菌株中缺失Trubc4并分析表型发现,Xyr1的过表达并不能恢复Trubc4缺失对纤维素酶表达造成的的下调。进一步的ChIP分析发现,Trubc4缺失导致Xyr1在纤维素酶基因启动子区的占据水平显著降低,这种降低即使在Xyr1过表达的情况下仍然存在。以TrUbc4为“诱饵”进行酵母双杂交文库筛选,获得了具有SWIB/MDM结构域的蛋白TrSnf12。该基因的缺失表型及蛋白细胞定位与TrUbc4类似,但是我们并没有检测到TrSnf12的泛素连接酶活性。综合上述结果,我们发现Trubc4在纤维素酶基因诱导表达过程中发挥着重要作用,此种作用是特异性的,并且依赖于其泛素结合酶活性。三、泛素修饰组学初步分析TrUbc4可能参与里氏木霉多种生理调控过程对TU6以及Trubc4缺失菌进行了泛素化蛋白质组学定量研究,鉴定到位于1385个蛋白上的2563个泛素化位点,其中941个蛋白的1623个位点包含定量信息。以1.5倍为变化阈值,在具有定量信息的泛素化位点中,△Trubc4/TU6比较组中有396个位点的修饰水平发生上调,298个位点的修饰水平发生下调,△Trubc4缺失导致里氏木霉整体的泛素化水平升高。进一步分析发现与TU6相比,有295个位点,258个蛋白在△Trubc4缺失菌中未检测到,这些蛋白涉及了转录因子、泛素结合酶、蛋白激酶、转运蛋白以及SAGA复合物,这说明Trubc4可能参与里氏木霉多种调控过程。四、Xyr1招募SWI/SNF复合物参与纤维素酶基因的表达调控酵母双杂交及体外GST-pull down实验发现,所鉴定的里氏木霉潜在的SWI/SNF复合物同源亚基TrSnf12与Xyr1的转录激活结构域(activation domain,AD)区存在相互作用,并且TrSnf12与同源核心亚基TrSwi1也存在相互作用。Trswi1及另一个同源核心亚基编码基因Trsnf5的缺失对里氏木霉的生长及生孢均具有严重的影响,并且使得纤维素酶的表达性能丧失。ChIP实验结果表明,在纤维素诱导条件下,TrSwi1及TrSnf5均能被招募至纤维素酶基因启动子区。进一步分析发现,在Xyr1过表达背景下,即使在非诱导条件下,TrSwi1也能被招募至纤维素酶基因启动子区,这说明Xyr1可能通过与TrSnf12之间的相互作用,通过靶向募集TrSwi1来介导纤维素酶基因启动子区的染色质结构变化,进而调控纤维素酶基因的表达。然而,对OExyr1△swi1/snf5的表型分析发现,在xyr1过表达的条件下,无论是诱导条件还是非诱导条件,Trswi1及Trsnf5的缺失对纤维素酶表达的影响程度都很小,这说明在xyr1过表达的条件下,纤维素酶基因的表达可能摆脱了对Trswi1及Trsnf5的绝对依赖。综上,在里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达过程中,染色质重塑复合物SWI/SNF发挥着重要的调控的作用。Xyr1可通过与TrSnf12亚基的相互作用招募TrSwi1/TrSnf5亚基到纤维素酶基因启动子区,从而调控纤维素酶的表达。