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目的:氧化应激是造成血管内皮慢性损伤、导致冠心病心绞痛等心血管疾病的重要机制。本文以临床治疗药物冠心宁注射液作为研究对象,利用叔丁基过氧化氢(tBHP)诱导建立血管内皮细胞EA.hy926损伤模型,通过体外实验研究冠心宁注射液及有效成分对细胞损伤的保护作用,并探讨其对细胞氧化应激损伤相关的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)-抗氧化反应原件(ARE)信号通路的调节机制,揭示冠心宁注射液保护血管内皮细胞损伤的分子作用机制。方法:(1)利用t-BHP诱导EA.hy926建立氧化损伤模型,采用MTT法筛选冠心宁注射液非毒性剂量、t-BHP损伤EA.hy926细胞合适浓度,进一步用MTT法测定冠心宁注射液在不同给药剂量、给药时间情况下对t-BHP诱导EA.hy926细胞损伤存活率的影响。通过分光光度法检测冠心宁注射液对抗氧化指标乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影响,利用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)自由基水平。(2)通过MTT法测定冠心宁注射液中主要活性成分阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、原儿茶醛、丹参素钠、丹酚酸B对t-BHP诱导EA.hy926细胞损伤的存活率和保护率的影响,使用Graphpad 7.0软件拟合出保护率曲线,计算出半数最大效应浓度(EC50)值。LDH释放实验检测活性成分对LDH释放能力,荧光定量PCR法检测活性成分对氧化通路中关键抗氧化酶血红素加氧酶1(HO-1)mRNA的表达水平,最终筛选得出冠心宁注射液发挥药效的主要有效成分。(3)利用荧光定量PCR法检测冠心宁注射液对Nrf2、醌氧化还原酶-1(NQO1)、HO-1 mRNA的调节变化;Western Blot法检测冠心宁注射液及其主要活性成分丹酚酸B对Keap1、HO-1、NQO1蛋白表达的影响、免疫荧光法检测Nrf2蛋白入核表达;同时引入Nrf2抑制剂ML385作为对照,Western Blot法检测冠心宁注射液对EA.hy926细胞下游关键蛋白HO-1和NQO1表达的影响,进而阐述冠心宁注射液通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路调控氧化应激诱导内皮细胞损伤的作用机制。结果:(1)在800μmol/L浓度的t-BHP处理细胞4 h作为损伤模型情况下,冠心宁注射液(1.25、2.5、5、10μL/mL)预处理(6、12、24 h)后可减轻细胞死亡、有效提高细胞存活率,且10μL/mL浓度的冠心宁注射液处理12 h下保护能力最为显著;冠心宁注射液可以上调SOD活性,下调LDH、MDA、ROS水平来起到缓解tBHP诱导细胞的损伤,起到保护内皮细胞的作用,呈现一定的剂量依赖性。(2)六种主要活性成分均对t-BHP诱导血管内皮细胞EA.hy926损伤呈现不同程度的保护效应,并对LDH的释放有一定的抑制作用,丹酚酸B(EC50为0.52μmol/L)对细胞的半数有效保护浓度优于丹参素钠(EC50为49.79μmol/L)、咖啡酸(EC50为8.28μmol/L)、原儿茶醛(EC50为6.49μmol/L)、迷迭香酸(EC50为6.48μmol/L)、阿魏酸(无法得出EC50);且400μmol/L丹酚酸B对于HO-1 mRNA的表达最显著(相比于正常组,P<0.01)。上述结果均表明冠心宁注射液的六种成分中丹酚酸B具有最强保护活性。(3)冠心宁注射液单独处理后能够上调HO-1、NQO1、Nrf2 mRNA和蛋白的表达(相比于正常组,P<0.05),呈现一定的剂量依赖性。在t-BHP损伤后,HO-1和NQO1的蛋白表达显著下调、Keap1蛋白表达上调(相对于正常组,P<0.05),冠心宁注射液和丹酚酸B处理后,HO-1和NQO1的蛋白表达升高、Keap1蛋白表达降低(相比于造模组,P<0.01);免疫荧光实验结果显示,冠心宁注射液和丹酚酸B处理后,Nrf2蛋白入核表达增多(相比于造模组,P<0.01);并在引入Nrf2抑制剂处理后,冠心宁注射液对下游关键蛋白HO-1和NQO1的表达下调。提示冠心宁注射液可以通过抑制Keap1蛋白表达,促进Nrf2与Keap1解偶联后的入核表达,并上调下游关键分子HO-1、NQO1 mRNA和蛋白表达来发挥血管内皮细胞的保护作用。结论:本研究表明,冠心宁注射液可以保护氧化应激引起的内皮细胞损伤,通过上调SOD的活力、下调LDH、MDA、ROS的含量起到减轻脂质过氧化、增强抗氧化能力而发挥作用。冠心宁注射液中六种主要酚酸类药效成分(阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、原儿茶醛、丹参素钠、丹酚酸B)均对内皮细胞的损伤有不同程度的保护作用,丹酚酸B是活性最强的成分。冠心宁注射液和丹酚酸B可通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路来发挥血管内皮细胞损伤的保护作用。