Trx系统是哺乳动物体内重要的氧化还原系统之一,其中TrxR1起到关键作用,它能特异性还原Trx1,支持细胞DNA合成、维持氧化还原平衡、同时参与凋亡信号抵抗等多种细胞进程。Trx系统活跃于肿瘤细胞,是支持肿瘤细胞无限增殖及转移的基础。药物小分子能够靶向抑制TrxR1,造成肿瘤细胞内部氧化还原失衡,如含金属抗癌药物、酚类化合物及醌类化合物。萘醌类分子靶向抑制TrxR1活性并经由TrxR1介导大量产生活性氧,导致细胞氧化还原失衡,使其成为潜在的肿瘤化疗药物。甲萘醌属于萘醌类化合物,是维生素K3的前体形式,具有很强的氧化还原活性.研究表明甲萘醌能够与TrxR1相互作用,但是具体机制和作用位点尚未解释清楚,因此,本文着重研究甲萘醌与TrxR1的作用方式和分子机制。TrxR1是由两个相同单聚体C端和N端逆向首尾相连的聚合而成的二聚体硒酶,具有C端和N端两个活性中心。我们针对大鼠TrxR1两个活性中心的三个关键性位点Cys⁵⁹、Cys⁶⁴、Sec⁴⁹⁸的完整形式和删减化形式进行特异性突变,经测序后利用大肠杆菌原核表达并进行DTNB还原检测,之后用野生型与突变体TrxR1同甲萘醌进行体外相互作用。我们发现,硒蛋白TrxR1的Sec⁴⁹⁸催化甲萘醌还原,但是U498C突变使甲萘醌还原更加高效。突变实验发现C端Cys⁴⁹⁸发挥主要催化还原作用,而N端Cys⁶⁴对甲萘醌还原的影响稍强于Cys⁵⁹。此外,不含硒的谷胱甘肽还原酶与TrxR1对比还原甲萘醌,并研究后者作用时的形态,表明了甲萘醌还原主要呈现非硒依赖性,且具有时间依赖和浓度依赖的特点。最后通过质谱分析鉴定甲萘醌与TrxR1相互作用。LC-MS结果发现TrxR1存在1分子甲萘醌加合物,推测其不可逆修饰硒蛋白C末端高反应活性的硒代半胱氨酸。本研究揭示了TrxR1可以非硒依赖方式催化甲萘醌,同时受到甲萘醌的不可逆抑制,为靶向TrxR1的萘醌类抗癌药物研发提供有益参考。