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假单胞菌属细菌是一类专性需氧型的革兰氏阴性杆菌,隶属γ-变形杆菌亚纲,其成员广泛分布于自然界中,是一类常见的环境微生物,与人类的生产生活密切相关。该属中不乏一些致病菌,例如人类机会致病菌铜绿假单胞菌和植物致病菌丁香假单胞菌,这些致病菌在细菌致病机理及生物防治等方面均有重要的理论研究和应用价值。HYS菌株是一株由本实验室分离并具有高产铁载体特性的假单胞菌,其产铁载体的能力是其他同类假单胞菌的三到四倍。本实验室前期研究发现以HYS菌株喂食秀丽隐杆线虫可使线虫寿命缩短,与喂食铜绿假单胞菌的线虫相比,HYS菌株喂食下的线虫寿命缩短更为显著,并且在致死过程中发现与以往报道不同的趋化现象,表明该菌株具有较强毒性,并且可能采取一种新的毒性机制。本研究首先依据多相分类方法对HYS菌株的分类地位进行了确定,然后基于HYS菌株对线虫致死的特殊性对该菌株的毒性机制进行了深入的研究。一.确定HYS菌株为一个新种P.donghuensis下的模式菌株。依照多相分类鉴定方法,分别从表型层面、遗传信息层面及化学成分层面对HYS菌株进行全面的特征描述。通过透射电子显微镜观察得到HYS菌株的单个细胞形态;通过对HYS菌株生长条件的检测得知其生长温度范围和对Na Cl浓度的耐受范围;通过构建16S r DNA序列的分子进化树得到与HYS菌株相近的菌种为P.vranovensis、P.asplenii、P.fuscovaginae和P.putida;通过分析脂肪酸组成,得知HYS菌株具有独特的Sum In Feature 1、17:1 isoω5c、18:1ω9c、19:0 iso及Summed Feature 1成分,不同于参考菌株;通过Biolog GN2检测得知HYS菌株能够独特地利用N-乙酰-D-葡萄糖胺和蔗糖;通过API 20NE检测得知HYS菌株的特征性生化反应是使明胶水解;通过DNA-DNA杂交检测到的HYS菌株与参考菌株的最大杂交值为58%,低于物种间的区分阈值70%;另外又结合实验室前期进行的对HYS菌株的基因组二代测序,基因组序列平均核苷酸一致性计算及醌型分析的工作,完成了对HYS菌株的全面检测。最终确定HYS菌株隶属于假单胞菌属下的一个新种,并得到同行认可,该菌种的鉴定为假单胞菌属菌种的多样性进行了补充,更为后续对HYS菌株进行深入的毒性机制研究提供了理论依据。二.HYS菌株是秀丽隐杆线虫的致病菌,该菌株对线虫最主要的作用方式是慢性致死。以秀丽隐杆线虫在生理行为上的变化为指标,对HYS菌株的致病性予以确定。在液体致死模型中,线虫在24 h内发生大量死亡;在快速致死模型中,未观察到HYS菌株发挥致死作用。在慢性致死模型中,用HYS菌株喂食的线虫其寿命不足正常培养条件下的1/3,半数致死时间(LT50)约为正常培养下的1/4。另外,在慢性致死模型中还观察到如下的线虫特征变化:暴露于HYS菌株菌苔上的线虫后代数量减少至不足正常情况下的1/10,线虫咽泵频率降低为正常状态下的1/2,线虫胚胎的孵化受到强烈抑制,线虫对HYS菌株有规避行为。以上结果证实HYS菌株是秀丽隐杆线虫的致病菌,该菌株对线虫的慢性致死作用是其发挥毒性的主要方式,同时还发现HYS菌株对线虫的致死和线虫对菌株的排斥作用之间存在相关性,为后续对该菌株毒性基因的筛选和深入研究提供了思路。三.HYS菌株对秀丽隐杆线虫的毒性作用主要受到Cbr/Crc系统的调控,Crc蛋白在其中起到负调控的作用。在确定了HYS菌株毒性和对线虫的排斥性之间的关系之后,对经转座子诱变方法构建的17,843株突变菌株进行筛选并得到68个与菌株毒性相关的基因,其中cbr A和cbr B基因不但对HYS菌株的毒性影响最大,其蛋白产物还组成Cbr A/Cbr B双组分调控系统,该系统与假单胞菌属细菌的毒性相关。通过构建与Cbr/Crc系统相关的一系列基因缺失突变菌株和回补菌株,证实了Cbr/Crc系统对HYS菌株毒性的调控作用,其中Crc蛋白发挥的负调控作用与之前的报道均不相同。另外,对Δcbr A、Δcbr B、Δcrc ZΔcrc Y及crc过表达菌株进行转录组测序,并在此基础上对筛得的其他66个毒性相关基因进行了Gene Ontology（GO）分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析,确定了Cbr/Crc系统在本实验体系下对HYS毒性调控的重要性。之后用突变线虫KU25和ZG31来替代N2野生型线虫进行慢性致死实验,发现了PMK-1/p38 MAPK信号通路在线虫抵御Cbr/Crc系统所调控的HYS毒性中发挥着作用。另外,初步检测到由HYS菌株分泌的铁载体（pyoverdine和7-HT）对线虫具有一定的毒性作用。以上结果说明HYS菌株主要通过以Crc蛋白负调控为中心的Cbr/Crc系统对秀丽隐杆线虫发挥毒性作用,并在P.donghuensis中揭示了其作用机制。综上所述,本研究将HYS菌株归类到假单胞菌属的一个新种下（P.donghuensis）,该菌株是其模式菌株,已被同行认可;基于HYS菌株的毒性和对线虫排斥作用之间的相关性建立了作用模型,确定了以Crc负调为中心的Cbr/Crc系统对HYS菌株毒性的调控机制。为丰富假单胞菌属多样性及深入研究菌株毒性机制提供重要的遗传信息;为Cbr/Crc系统在假单胞菌属细菌毒性调控中的作用机制提供重要补充。