论文部分内容阅读
研究背景和目的:慢性下腰痛(Chronic lower back pain,CLBP)是临床重要的致残因素之一,全球约60%-80%的人在一生中要经历CLBP的症状。研究发现,椎间盘退变是CLBP最重要的致病因素。从解剖学角度,椎间盘主要由上下位的软骨样终板结构,中间的胶冻样髓核组织、以及四周围绕的纤维环结构组成。其中,目前研究者广泛认为髓核组织发生退行性变化是椎间盘退变的早期始动因素。椎间盘退变是一种多因素导致的病理性变化,基因和环境等因素在其发生中扮演重要角色。椎间盘退变有明确的组织细胞学表现,其发生常常伴随髓核组织细胞外基质合成能力降低,基质分解增加,同时伴随炎症因子分泌增加和炎性细胞浸润。这些病理生理学变化将进一步导致细胞外基质重塑,包括髓核组织基质降解酶(matrix metalloproteinases,MMPs,和a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs proteins,ADAMTS)表达增加,和细胞外基质的蛋白(Ⅱ型胶原和蛋白聚糖)含量将会逐渐减少。同时,退变的椎间盘伴随神经血管长入,最终导致椎间盘生物力学功能丧失,引起CLBP症状。因此,延缓椎间盘髓核组织细胞外基质的退行性变化以及维持髓核细胞的数量对于椎间盘退变的预防和治疗具有重要意义。本课题拟采用高通量蛋白组学测序的方法对人正常椎间盘髓核组织和退变的髓核组织蛋白表达变化进行差异分析,旨在探究差异蛋白或者通路在退变的椎间盘髓核组织表达变化特点。进一步,研究者拟通过人髓核细胞转录组学测序方法结合体内动物模型和体外细胞模型实验,系统阐明蛋白组学分析发现的差异蛋白或者通路与椎间盘退变的内在联系以及其促进椎间盘退变的关键分子机制。本课题研究结果将为未来开发治疗椎间盘退变新的治疗方案奠定理论基础。第一部分:蛋白组学揭示组织肾素-血管紧张素系统与椎间盘退变的相关性方法:(1)依据T2加权磁共振下椎间盘Pfirrmann评分,术中收集正常和退变的椎间盘髓核组织;(2)一部分正常或退变轻(Ⅱ级)的髓核组织和退变严重(Ⅳ级)的髓核组织进行蛋白组学测序,一部分正常或退变轻的(Ⅱ级)髓核组织用来体外提取原代髓核细胞;(3)采用甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光对所获得的细胞进行鉴定;(4)对蛋白组学测序结果进行生物信息学分析,寻找差异蛋白和相关通路;(5)采用组织学和分子生物学分析方法(免疫组化、组织TUNEL检测、实时荧光定量PCR、和蛋白免疫印迹法)探究肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system,RAS)组分在不同退变级别椎间盘髓核组织的表达变化特点;(6)采用酶联免疫吸附实验探究正常人和椎间盘退变患者外周血血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)水平差异;(7)构建腰椎间盘退变模型小鼠,通过影像学和组织学评估小鼠模型腰椎间盘退变状况;(8)采用分子生物学技术评估模型鼠髓核组织RAS组分表达变化;(9)采用酶联免疫吸附实验探究正常小鼠和椎间盘退变小鼠外周血AngⅡ水平差异。结果:(1)研究者体外成功获得人原代髓核细胞,并且通过细胞形态学和分子生物学手段(免疫荧光和甲苯胺蓝染色)对所获得的髓核细胞进行了验证;(2)蛋白组学测序发现,退变的椎间盘髓核组织存在RAS组分高表达;(3)体外组织学和分子生物学分析方法证实了炎症刺激可以导致RAS的激活,与炎症强度正相关;(4)低浓度AngⅡ有利于髓核细胞RAS激活,而高浓度AngⅡ抑制髓核细胞局部RAS激活。(5)和正常人相比,椎间盘退变患者外周血AngⅡ水平明显较高,且AngⅡ与患者椎间盘退变分级存在良好的相关性以及对椎间盘退变表现出良好的预测能力;(6)腰椎椎间盘退变小鼠椎间盘组织RAS组分存在激活,且小鼠外周血AngⅡ水平高于假手术组,与椎间盘退变患者外周血AngⅡ水平特点具有一致性。结论:椎间盘组织RAS的激活与椎间盘退变的发生变关系密切,且AngⅡ与患者椎间盘退变分级存在良好的相关性以及对椎间盘退变表现出良好的预测能力。以上研究结果为寻找椎间盘退变新的实验室诊断指标以及后续探究AngⅡ调控椎间盘髓核细胞退变的内在机制提供了扎实的基础保障。第二部分:血管紧张素Ⅱ对椎间盘髓核细胞功能的影响和调节机制研究方法:(1)体外AngⅡ处理人髓核细胞进行转录组测序分析;(2)Cell counting kit-8(CCK8)法检测AngⅡ对于髓核细胞活性的影响;(3)β-半乳糖醛苷酶检测AngⅡ对于髓核细胞衰老的影响;(4)线粒体膜电位检测AngⅡ对于髓核细胞线粒体膜电位的影响;(5)TUNEL法检测AngⅡ对于髓核细胞凋亡的影响;(6)细胞活性氧检测AngⅡ对于髓核细胞氧化应激水平的影响;(7)酶联免疫吸附实验检测AngⅡ对于髓核细胞炎症因子分泌的影响;(8)细胞免疫荧光检测AngⅡ对于髓核细胞退变和纤维化表型的影响;(9)自发性高血压大鼠探究体内高AngⅡ水平对于椎间盘自然退变的影响。结果:(1)转录组学结果表明AngⅡ处理后,髓核细胞退变相关基因、炎症反应相关基因、纤维化相关基因、以及神经血管生成相关基因的表达均有显著增加;(2)KEGG分析AngⅡ处理后髓核细胞细胞因子与其受体相互作用通路、肿瘤坏死因子通路、白细胞介素17通路、以及风湿性关节炎相关通路等被明显激活;(3)AngⅡ抑制髓核细胞活性、促进髓核细胞衰老;(4)AngⅡ促进人髓核细胞的凋亡;(5)AngⅡ增加髓核细胞内氧化应激水平;(6)AngⅡ促进人髓核细胞退变和纤维化表型的发生;(7)AngⅡ促进人髓核细胞炎症小体的激活和炎症因子的分泌;(8)与对照组相比,自发性高血压大鼠椎间盘髓核组织RAS组分明显激活,且更易发生自发性椎间盘退变。结论:(1)AngⅡ显著促进髓核细胞退变、纤维化、神经血管生成等退变相关基因的表达;(2)AngⅡ可以降低人髓核细胞的细胞活性,促进髓核细胞凋亡、衰老、氧化应激、和炎症激活,并能促进M1型巨噬细胞极化;(3)AngⅡ可促进人髓核细胞的退变和纤维化表型;(4)外周血高AngⅡ水平和局部RAS激活可以加速老龄SHR的椎间盘退变的发生;(5)Nrf2/NF-κB信号通路在RAS促进椎间盘退变过程中可能扮演者重要的角色。综上,AngⅡ通过激活髓核细胞氧化应激和炎症反应导致细胞凋亡、衰老、以及退变相关表型,参与椎间盘退变的发生发展。第三部分:血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(坎地沙坦)对椎间盘退变治疗的研究方法:(1))Cell counting kit-8(CCK8)法检测坎地沙坦对于AngⅡ处理后髓核细胞活性的影响;(2)TUNEL法检测坎地沙坦对于AngⅡ处理后髓核细胞凋亡的影响;(3)实时荧光定量PCR检测坎地沙坦对于AngⅡ处理后髓核细胞退变相关基因表达的影响;(4)细胞免疫荧光检测坎地沙坦对于AngⅡ处理后髓核细胞炎症反应、氧化应激、以及退变和纤维化表型的影响;(5)通过影像学和组织学方法在尾椎椎间盘退变小鼠模型中探究坎地沙坦对于椎间盘退变的治疗效应。结果:(1)体外细胞实验表明坎地沙坦缓解AngⅡ介导的髓核细胞凋亡、炎症反应、和氧化应激;(2)体外细胞实验表明坎地沙坦缓解AngⅡ介导的髓核细胞退变表型;(3)影像学和组织形态学分析表明坎地沙坦能够缓解针刺介导的小鼠尾椎椎间盘退变;(4)组织免疫荧光分析表明坎地沙坦能够缓解针刺介导的小鼠尾椎椎间盘髓核细胞炎症相关蛋白和因子的表达;(5)组织免疫荧光分析表明坎地沙坦能够缓解针刺介导的小鼠尾椎椎间盘髓核细胞活性降低和细胞凋亡增加;(6)组织免疫荧光分析表明坎地沙坦能够缓解针刺介导的小鼠尾椎椎间盘髓核细胞退变表型和纤维化表型。结论:在一定浓度范围内(10n M-100n M),AGTR1拮抗剂,坎地沙坦,在体外试验中通过降低人髓核细胞凋亡、炎症反应、和氧化应激拮抗AngⅡ而发挥缓解髓核细胞退变的作用。在体内实验中,坎地沙坦治疗能够缓解针刺介导的椎间盘髓核组织局部细胞凋亡和炎症反应而发挥延缓椎间盘退变的治疗效果。总之,椎间盘RAS组分未来有望成为椎间盘退变治疗临床新靶点。小结:本研究首先采用高通量蛋白组学分析人正常和退变的椎间盘髓核组织,发现肾素血管紧张素系统在退变的椎间盘髓核组织中显著激活。通过组织学研究揭示了在退变的椎间盘髓核组织中,肾素血管紧张素系统组分表达明显增加。体外细胞实验和动物模型实验也进一步验证了RAS组分激活与椎间盘退变的密切相关性,且在髓核细胞水平存在AngⅡ-RAS反馈机制。同时,通过对正常人和椎间盘退变患者外周血AngⅡ水平进行分析,明确了AngⅡ与患者椎间盘退变分级存在良好的相关性以及对椎间盘退变表现出良好的预测能力。随后,在细胞实验中,研究者采用转录组学分析和细胞实验研究相结合揭示了AngⅡ通过促进人髓核细胞功能障碍导致椎间盘退变及内在调控机制。动物模型实验也证实了RAS过度激活可以加速椎间盘退变。最后,研究者通过体内和体外实验发现了坎地沙坦对于拮抗AngⅡ导致的髓核细胞功能障碍以及缓解针刺介导的椎间盘退变的治疗效应。本课题研究结果将为开发椎间盘退变新的治疗方案奠定理论基础。