山核桃细胞分裂素反应调节因子RR家族基因克隆及其在嫁接过程中功能初步研究

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山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是一种产于我国浙江及安徽地区的木本油料树种,属于胡桃目(Juglandales)胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya),其果实风味独特,具有较高营养价值,是浙江省发展“一亩山万元钱”的重要经济树种。然而,实生的山核桃存在童期长、树体高大不易采摘、良种化程度较低等一系列限制山核桃产业经济发展的不利因素。嫁接是一种在园艺中广泛使用的技术,通过对山核桃进行嫁接可在一定程度上解决上述不利因素。嫁接中砧木与接穗的成功愈合涉及多种激素的共同调控,其中细胞分裂素对于创口的愈合及后续分化起着关键作用。反应调节因子(Response Regulator,RR)在细胞分裂素信号通路中起接收上游激素信号,激活下游功能基因转录及调控多种激素信号网络的作用,然而RR在山核桃嫁接过程中参与嫁接结合处愈合的调控机理尚不清楚。本研究以山核桃作为主要材料,鉴别并克隆了山核桃RR家族基因;分析了CcRRs生物信息学特征;测定了嫁接成活过程中反式玉米素核苷的动态变化;研究了CcRRs组织特异性及嫁接成活过程中的表达模式;分析了CcRRs启动子激素响应顺式作用元件,并研究其与基因之间的诱导关系;构建了CcRRs过表达载体,并探究了亚细胞定位模式。主要研究结果如下:(1)克隆获得17个CcRR基因CDS全长序列,其中共有8个A型、8个B型、1个C型基因。CcRR基因家族编码蛋白均为亲水性蛋白。各亚型基因家族均具有其特征接收器蛋白结构域,此外B型还具有MYB-like DNA结合结构域(CcRR11除外)。(2)山核桃嫁接成活过程中,内源细胞分裂素反式玉米素核苷含量呈现嫁接后3天上升、嫁接后7天维持在嫁接3天水平、嫁接后14天下降、嫁接后30天恢复正常水平的动态变化。嫁接过程的转录组测序结果表明,与嫁接后0天对比,砧木和接穗中超过50%的A型和B型CcRRs在嫁接后7天和14天为差异表达基因(嫁接后14天接穗中除外),但嫁接后7天与14天对比,差异表达基因的比例在0~4.35%之间。CcRR2、CcRR4、CcRR10、CcRR22分别在果皮、胚、根、种皮中相对表达量较高,CcRR5、CcRR11在茎中相对表达量较低。CcRRs的定量验证结果表明,与嫁接后0 d相比,嫁接后3 d,接穗中12个CcRRs表达量上调;嫁接后7 d砧木和接穗中分别有6个和11个CcRRs表达量上调;嫁接后14 d砧木和接穗中分别有9个和4个CcRRs表达量上调;嫁接后30 d砧木和接穗中9个CcRRs表达量恢复至嫁接前水平。CcRR5在接穗中表达量持续上调;CcRR4、CcRR22表达受到抑制;CcRR8在嫁接后7 d和14 d呈现高表达。(3)山核桃RR基因启动子上包含大量生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸相关的顺式作用元件,且其表达受激素的诱导。例如CcRR4启动子包含生长素响应元件,在IAA处理后相对表达量上调。(4)亚细胞定位结果表明A型CcRRs定位于细胞核、细胞膜与细胞核;B型CcRRs定位于细胞核;C型CcRR定位于细胞核与细胞膜。通过异源转化拟南芥的方式,分别获得CcRR1、CcRR5、CcRR10、CcRR12a、CcRR12b转基因纯合体株系3、15、7、4、16株。
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