山核桃基腐病病原鉴定、分子检测及抑菌物筛选

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山核桃是我国重要的经济林树种,主要分布在浙、皖交界的天目山区,具有重要的经济价值。随着集约化经营规模不断扩大,山核桃病虫害等问题日益严重。最近,山核桃基腐病发生严重,导致大量树木死亡,造成严重的经济和生态损失。本研究围绕该病害的发生规律、早期诊断技术、生防微生物的筛选等方面开展了研究,主要研究结果如下:1.采用野外调查等方法调查了临安湍口镇和龙岗镇的山核桃基腐病发病情况。结果发现从2018年至2019年,临安湍口、龙岗山核桃种植林区有症状植物的发病率分别从2018年的1.6%和1.2%上升到2019年的2.4%和2.2%。山核桃根系出现坏死,坏死扩展到茎,导致茎基腐烂和溃疡。后期坏死斑往横向和纵向扩展,从植物基部往上可蔓延至1米以上,形成大面积坏死,地上部位表现出靠近坏死一边的枝条枯死,提前落叶;严重时,当病斑环绕树干一圈后,植株整体枯死。2.采用病菌分离、室内接种以及病原鉴定等方法,明确了山核桃基腐病病原菌。通过组织分离法和叶片诱饵法从基部组织和土壤组织分离了48株分离物,通过形态学鉴定、分子生物学鉴定(ITS4/ITS6、Cox I-Levup/Cox I-Levlo)。主要是2种病菌,其中腐霉Pythium vexans有30株分离物,樟疫霉Phytophthora cinnamomi有18株分离物。通过伤口接种法进行致病性检测,完成科赫验证,发现樟疫霉的致病性显著高于腐霉,且坏死症状同林间发病症状相似从而确定樟疫霉为山核桃基腐病的病原菌。3.建立樟疫霉LAMP快速检测技术。选用基因Pcinn100006为靶标基因,长度为280bp,对该技术的特异性、灵敏度和实际应用进行了测定。特异性检测显示,LAMP方法能特异性地检测出樟疫霉,而腐霉Pythium vexans、茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、禾谷镰孢菌Fusarium graminearum均未检测出来。灵敏度显示,LAMP方法的灵敏度为0.189 pg·μL-1,是普通PCR灵敏度的100倍。在实际应用中,LAMP方法能够快速检测出发病植物组织和根际土壤中的樟疫霉。4.采用菌丝生长抑制法测定了三乙磷酸铝、氟噻唑吡乙酮、亚磷酸钾对樟疫霉ST402的抑制效果,其中三乙磷酸铝的EC50为48μg·mL-1,氟噻唑吡乙酮的EC50为0.069μg·mL-1,氟噻唑吡乙酮的效果最好,而亚磷酸钾室内平板抑制效果不明显。通过平板对峙法筛选了木霉属、链霉菌属、芽孢杆菌属等生防菌,发现木霉Trichoderma对樟疫霉有竞争优势,链霉菌Streptomyces platensis D3、Streptomyces rapamycinicus29253、Streptomyces axermitilis 31272效果较好,多粘类芽孢杆菌(CF05)拮抗效果明显高于其他芽孢杆菌属,枯草芽孢杆菌对樟疫霉有一定的抑制效果。综上所述,本研究发现基腐病在山核桃种植林区发生严重,威胁山核桃种植,首次明确了山核桃基腐病的病原为樟疫霉,建立了基于LAMP检测的山核桃土壤中樟疫霉快速检测技术,筛选出高效抑菌活性的化学药剂和生防微生物,为山核桃基腐病的综合防治提供了理论基础。
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