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抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是清除活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)的重要酶类,作为酶促类的抗氧化剂,和其他类型的抗氧化剂一起调节植物体内的ROS代谢,维持植物正常的生长发育。APX-方面利用抗坏血酸(ascobateacid,AsA)作为特殊的电子供体,催化H202转变为H20,从而阻止胁迫条件下生物体中积累过量的H202;另一方面,在抗坏血酸-谷月7甘肽循环中APX在AsA和谷胱甘肽再生过程中发挥至关重要的作用。橡胶树死皮限制天然橡胶单产的提高,已被公认为是一种由割胶(伤害)和乙烯刺激引起的生理综合症。强割和强刺激一方面可引起胶乳黄色体膜上NADPH氧化酶活性增强和ROS的含量增加。另一方面,乳管细胞中ROS的酶促和非酶促清除系统成分亏缺,ROS清除相关基因或蛋白表达下调:抗坏血酸等抗氧剂浓度显著下降,引起ROS产生与清除失衡,致使乳管细胞中ROS大量积累,多余的ROS破坏黄色体膜结构的稳定性,引起黄色体破裂,释放出二价金属阳离子等凝固因子,造成胶乳原位凝固,堵塞乳管,最终导致死皮发生。据此,我们推测ROS过量积累是橡胶树死皮发生的诱因,鉴于APX在维持ROS平衡中的重要作用,对APX进行深入研究有望解析其在橡胶树及死皮中的作用。
本研究选取橡胶树(llevea brasiliensis)品系热研7-33-97为实验材料,利用PCR和测序技术获得8个橡胶树APX基因。进一步对这8个蛋白序列进行生物信息学分析,对这8个基因进行表达分析。根据上述研究结果,选取HbAPX2在酵母中进行功能鉴定。主要研究结果如下:
1、利用PCR和测序技术得到8个橡胶树APX基因,分别命名为HbAPXl-8,并对其相应编码蛋白进行生物信息学和进化分析,结果如下:
(1)理论等电点结果显示:HbAPXl等电点小于6(5.78),HbAPX3、HbAPX5和HbAPX8等电点大于8(8.22~8.47),其余等电点在6和7之间(6.08~6.77)。
(2)亚细胞定位预测结果显示:HbAPX1、HbAPX3和HbAPX5等定位到细胞质,HbAPX4、HbAPX6、HbAPX7和HbAPX8等定位到叶绿体内,HbAPX2定位到线粒体内,说明橡胶树APX功能多样。
(3)系统进化树分析显示:除HbAPX4外,橡胶树APX与同属大戟科的木薯、蓖麻、麻风树APX蛋白的亲缘关系较近,与水稻、玉米的亲缘关系较远。
2、利用实时荧光定量PCR技术系统分析了HbAPX1-8在不同组织、健康和死皮橡胶树、死皮诱导因子处理以及胁迫处理下的表达模式,结果显示:HbAPX2在树皮中的表达量最高,HbAPX3、HbAPX4、HbAPX6和HbAPX7在叶片中的表达量最高,HbAPX1和HbAPX5在茎尖中的表达量最高,HbAPX8在雄花中的表达量最高。除HbAPX7在死皮和健康树树皮中表达无显著差异外,其余基因在死皮树胶乳和树皮中表达均高于健康树。伤害、高盐、干旱、低温、过氧化氢等处理均能调控橡胶树APX表达:此外,橡胶树APX表达受乙烯调控,暗示其参与橡胶树胁迫和激素应答反应并与橡胶树死皮相关。
3、构建了酵母表达载体pYES2-llbAPX2,并将载体转化到酵母菌株INVScl当中,随后进行氧化和干旱胁迫处理。结果显示:氧化和干旱胁迫条件下,表达HbAPX2的酵母菌株长势明显优于对照,说明HbAPX2的表达能增强酵母对氧化和干旱胁迫的抗性。
本研究选取橡胶树(llevea brasiliensis)品系热研7-33-97为实验材料,利用PCR和测序技术获得8个橡胶树APX基因。进一步对这8个蛋白序列进行生物信息学分析,对这8个基因进行表达分析。根据上述研究结果,选取HbAPX2在酵母中进行功能鉴定。主要研究结果如下:
1、利用PCR和测序技术得到8个橡胶树APX基因,分别命名为HbAPXl-8,并对其相应编码蛋白进行生物信息学和进化分析,结果如下:
(1)理论等电点结果显示:HbAPXl等电点小于6(5.78),HbAPX3、HbAPX5和HbAPX8等电点大于8(8.22~8.47),其余等电点在6和7之间(6.08~6.77)。
(2)亚细胞定位预测结果显示:HbAPX1、HbAPX3和HbAPX5等定位到细胞质,HbAPX4、HbAPX6、HbAPX7和HbAPX8等定位到叶绿体内,HbAPX2定位到线粒体内,说明橡胶树APX功能多样。
(3)系统进化树分析显示:除HbAPX4外,橡胶树APX与同属大戟科的木薯、蓖麻、麻风树APX蛋白的亲缘关系较近,与水稻、玉米的亲缘关系较远。
2、利用实时荧光定量PCR技术系统分析了HbAPX1-8在不同组织、健康和死皮橡胶树、死皮诱导因子处理以及胁迫处理下的表达模式,结果显示:HbAPX2在树皮中的表达量最高,HbAPX3、HbAPX4、HbAPX6和HbAPX7在叶片中的表达量最高,HbAPX1和HbAPX5在茎尖中的表达量最高,HbAPX8在雄花中的表达量最高。除HbAPX7在死皮和健康树树皮中表达无显著差异外,其余基因在死皮树胶乳和树皮中表达均高于健康树。伤害、高盐、干旱、低温、过氧化氢等处理均能调控橡胶树APX表达:此外,橡胶树APX表达受乙烯调控,暗示其参与橡胶树胁迫和激素应答反应并与橡胶树死皮相关。
3、构建了酵母表达载体pYES2-llbAPX2,并将载体转化到酵母菌株INVScl当中,随后进行氧化和干旱胁迫处理。结果显示:氧化和干旱胁迫条件下,表达HbAPX2的酵母菌株长势明显优于对照,说明HbAPX2的表达能增强酵母对氧化和干旱胁迫的抗性。