橡胶草抗坏血酸过氧化物酶基因家族分析及TkAPX3的功能研究

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橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)作为世界三大产胶作物之一,其根部产生的天然橡胶与巴西橡胶树所产橡胶的结构及性能相当并且具有生长周期短,生长适应性强,遗传转化相对容易等优点,是最有发展前景的天然橡胶产胶潜在替代植物之一。我国耕地盐渍化严重,盐碱地约为总耕地面积的五分之一,且多集中在西北、东北、华北地区。同时这些地区也是橡胶草生长的主要地区,所以提高橡胶草的抗盐能力对其生长及产量至关重要。橡胶草是一种喜凉冷的草本作物,在海南的种植受到了一定程度的限制,提高其抗高温能力打破温度对其分布的限制,将有利于橡胶草的研究及商业化种植。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是抗坏血酸-谷胱甘肽循环过程中的关键酶,能够清除植物体内过量的H2O2,在植物抵抗逆境胁迫的过程中发挥重要作用。该研究利用生物信息学方法鉴定及分析了橡胶草APX基因家族,并对逆境胁迫(冷、热、盐、旱)和激素(乙烯、茉莉酸)处理后APX基因家族成员表达情况进行了分析,克隆了橡胶草TkAPX3基因,利用农杆菌转化法将TkAPX3基因的过表达载体转入橡胶草,对该基因的功能进行了初步的分析。主要结果如下:(1)该研究利用生物信息学方法,在橡胶草全基因组中鉴定出7个Tk APXs基因家族成员,进一步分析发现7个成员中有一对是复制基因(Tk APX4/Tk APX6)。进化分析结果显示,7个基因可分为4个亚组;染色体定位分析表明,Tk APX基因家族成员分布广泛,7个Tk APXs基因位于7条不同的染色体上;亚细胞定位预测表明,Tk APX1、TkAPX3、Tk APX5和Tk APX7定位于细胞质,Tk APX4和Tk APX6定位于质膜,Tk APX2定位于叶绿体。启动子区域顺式作用元件分析结果显示,橡胶草APX基因含有大量的应激反应元件,推测APX基因可能对各种外界刺激和胁迫存在灵敏的应激反应机制。(2)qRT-PCR分析表明,橡胶草7个TkAPXs基因家族成员在花萼、花瓣、花梗中表达量均较低,大多数Tk APXs在根茎叶中的表达水平大于花及胶乳,其中Tk APX1在根和茎中的表达水平最高,推测Tk APX1基因可能在橡胶草生长发育过程中起重要作用。进一步对Tk APX基因家族在逆境胁迫(冷、热、盐、旱)和激素(乙烯、茉莉酸)处理下的表达分析显示,TkAPX3在根及叶中的表达水平较对照均大幅度升高,推测TkAPX3基因可能在橡胶草应答逆境胁迫和激素处理反应过程中起重要作用。(3)利用PCR技术首次从橡胶草中分离得到了细胞质型的抗坏血酸过氧化物酶基因TkAPX3,其开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸,蛋白分子质量为27.52 k D,等电点为5.23。构建了含有Super启动子的植物过表达载体p Super1300-TkAPX3,转化农杆菌GV3101后,用叶盘法侵染橡胶草,得到转基因橡胶草。(4)与野生型橡胶草相比,在适宜的生长条件下,转基因橡胶草具有一定的生长优势。当受到相同的盐胁迫、高温胁迫下,过表达TkAPX3基因显著提高了橡胶草的APX活性,降低了H2O2的积累,这些结果表明过表达TkAPX3基因提高了橡胶草对盐及高温胁迫的耐受性,从而保护橡胶草免受盐、高温胁迫造成的氧化损伤。
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