本研究分为二部分：　　第一部分：miR-1273g-3p通过靶向CNR1调节A549细胞迁移能力　　MiRNA(microRNA)是一类由22个左右核苷酸组成的小分子非编码RNA，目前发现miRNA与许多生理病理过程密切相关，如生长发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤形成和病毒感染等。目前，miRNA的加工成熟途径研究的已经比较清楚。首先，细胞核内编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录成长的初级miRNA(pri-miRNA)，长度约为300-1000bp，接着pri-miRNA在Drosha酶和它的伴侣分子(DGCR8)组成的复合物的作用下，剪切为约70-90个核苷酸长度，具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA在转运蛋白Exportin-5的作用下，从核内运输到胞质中。随后pre-miRNA在Dicer酶（双链RNA专一的RNA内切酶）的作用下被剪切成21-25个核苷酸，而且5端磷酸化、3末端有2nt的突起的类似于siRNA的不完全配对的双链miRNA，双链miRNA是由成熟miRNA与miRNA*组成的二聚体，miRNA与miRNA*位置相互对应。最后在未知RNA解旋酶作用下生成单链miRNA，成熟miRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中发挥作用。成熟的miRNA通过与靶基因3 UTR的结合抑制翻译或直接降解mRNA，这种结合是通过miRNA上的种子序列与3 UTR互补靶序列完全或部分匹配的。　　根据miRNA序列特异性作用，通过计算预测发现，miRNA可以靶向60％的mRNA。此外，miRNA还具有以下三方面的特性:1.时空特异性，miRNA的表达具有时间和空间特异性，在生长发育过程及其不同细胞、组织、器官中，miRNA的表达谱具有很大差异;2.多靶效应，一个miRNA可以靶向多种不同的mRNA，同样多个miRNA也能够同时靶向一个mRNA;3.微调性，很多miRNA对靶标的影响（降解或者翻译抑制）一般不会超过50％。　　肺癌是最常见的恶性肿瘤，是严重威胁人类生命的杀手之一，全球每年约有100多万人死于肺癌，肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，而非小细胞肺癌又占肺癌总数的80％～90％。肺癌的发生受多种因素影响，表现为多阶段的复杂过程，发病机制至今尚不清楚，伴随着分子生物学的发展，当前医学界对肺癌的研究方向主要集中在肿瘤易感基因、抑癌基因、细胞信号传导、凋亡调控等方面。近年来，miRNA的出现为更好地在分子水平了解肺癌提供了一个新的平台和工具，已经成为当前肿瘤研究的热点之一。　　内源性大麻素系统主要包括大麻素受体、内源性配体和它们相关的合成及降解酶，到目前为止已经鉴定了两种大麻素受体分别是CNR1和CNR2。CNR1在中枢神经系统和周围组织表达，特别是和能量平衡相关的:脂肪组织、肝脏、骨骼肌等。越来越多的文献证明内源性大麻素系统在调节能量代谢和癌症相关疾病中发挥重要作用，在癌细胞中的主要作用机制是影响细胞增殖、细胞周期、细胞迁移、肿瘤细胞血管发生和促进细胞程序性死亡等，如有文献报道通过药物和遗传方式降低CNR1的表达能够抑制血管发生、细胞增殖和细胞迁移等。　　本论文的研究目的是寻找及鉴定A549细胞中异常高表达的miR-1273g-3p的功能性靶基因，并进一步检测其在非小细胞肺癌细胞A549中的生物学功能。主要研究内容分为以下几个方面:　　1.检测miR-1273g-3p在非小细胞肺癌细胞H1299、H460和A549细胞中的表达情况　　我们通过H1299和H460细胞miRNA芯片，发现miR-1273g-3p在H1299和H460细胞中表达量非常高，提取H1299、H460和A549细胞总RNA进行Ploy(A)加尾，利用技术检测H1299、H460和A549细胞中miR-1273g-3p的水平。实验结果表明miR-1273g-3p在H1299、H460和A549细胞中的表达水平比U6还要高，表明miR-1273g-3p是一个异常高表达的miRNA。　　2.miR-1273g-3p靶标的寻找和确证　　a.结合H1299和H460细胞mRNA芯片和生物信息学预测，我们发现CN-R1、MGA、ZFX、SYNCRIP和APBB2可能是miR-1273g-3p的靶标。向A549细胞转染miR-1273g-3p mimic后提取细胞总RNA，然后逆转录成cDNA，再通过qPCR检测预测靶基因的mRNA水平变化。结果显示除了CNR1的mNRA水平显著下调外，MGA、ZFX、SYNCRIP和APBB2几个基因的mRNA水平无明显变化，以上结果表明CNR1可能是我们要寻找的miR-1273g-3p的靶标。　　b.荧光素酶实验。将构建好的CNR13UTR荧光素酶报告载体转染到A549细胞后，利用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶的活性变化。结果发现miR-1273g-3p对CNR13UTR的两个靶位点都发生作用。　　c.免疫印迹实验检测靶基因蛋白水平变化。过表达或敲低A549细胞中miR-1273g-3p后，提取A549细胞总蛋白，通过免疫印迹实验检测CNR1表达量变化。结果发现miR-1273g-3p能够负调控CNR1在A549细胞内的表达量。　　以上结果说明miR-1273g-3p能够在在A549细胞中靶向CNR1。　　3.miR-1273g-3p通过靶向CNR1的生物学意义　　a.细胞增殖实验。向A549细胞中转染miR-1273g-3p mimics、miR-1273g-3pinhibitor和CNR1 siRNA， MTS方法检测细胞增殖情况。实验结果表明各转染组相对于对照组细胞增殖情况无明显变化。　　b.细胞划痕实验。向A549细胞中转染miR-1273g-3p mimics、miR-1273g-3pinhibitor和CNR1 siRNA，然后用无菌黄枪头在各组中划痕，每隔一段时间拍照记录。结果发现，在A549细胞中转染miR-1273g-3p mimics和CNR1 siRNA均可以促进A549细胞的迁移，而加入anti-mir-1273g-3p能够抑制这种现象。表明miR-1273g-3p有可能作为原癌基因，促进非小细胞肺癌细胞A549迁移。　　综上所述，我们首次研究了miR-1273g-3p在非小细胞肺癌细胞的表达情况，并利用生物信息学预测、qPCR、western blot、双荧光素酶报告基因系统等实验手段证明了CNR1是miR-1273g-3p的靶标。同时发现miR-1273g-3p可通过调控CNR1促进细胞的迁移。　　第二部分：miRNA调控相关蛋白Ku70及其突变体表达纯化　　Ku蛋白是DNA结合蛋白，进化上相对保守，在不同物种中均发现有同源Ku蛋白。Ku蛋白广泛存在于不同组织中，其mRNA的含量在胸腺和淋巴细胞中更丰富，Ku蛋白主要存在于细胞核中，也有报道在细胞膜和细胞质中存在。　　人类Ku蛋白是由2条多肽链通过非共价键紧密结合形成的异二聚体结构，分别称为Ku80(XRCC5)和Ku70(XRCC6)。人Ku80基因位于2q33-34染色体，编码蛋白含732个氨基酸(AA)，相对分子量约83 kDa。人Ku70基因位于染色体22q13染色体，编码蛋白含609个氨基酸(AA)，相对分子质量为69 kDa。Ku80与Ku70有一定的相互作用区域，也均有与DNA末端结合的特定区域，这也是与DNA结合的分子基础。研究认为Ku80的C端32 kDa与Ku70的C端20kDa是形成异二聚体的结合部位。进一步研究认为，Ku80的第449-477位AA是两亚基相互作用的重要部位。Wang等人报道Ku80的第371-510位AA是与Ku70相互作用的部位;Ku80 C端的第179-732位氨基酸对DNA的末端结合是必要部位;Ku70的第536-609位AA是与DNA结合的核心结构域。Ku蛋白的稳定性可能依赖于两亚基的相互依存。　　由Ku70/Ku80两亚基紧密结合形成的异二聚体结构，与DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)结合形成DNA依赖的蛋白激酶全酶(DNA-PK)，在双链DNA断裂(DSBs)的非同源末端结合(NHEJ)修复途径中发挥重要作用。此外，Ku蛋白在维持端粒结构也有着重要作用。Ku蛋白缺失会造成小鼠成纤维细胞明显的染色体的畸变和淋巴瘤的发生。Ku蛋白的活性可能与肿瘤的发生发展相关[8]。Ku蛋白的DNA末端结合(DEB)活性与肿瘤的耐药性相关[9]。因此，Ku蛋白作为一个潜在的肿瘤治疗靶点而一直受到人们关注。　　我们关注的是Ku蛋白的DNA结合特性和DNA解旋酶活性，联想这些作用是否同样适用于RNA序列上？文献调研发现，Silvera曾利用酵母三杂交系统发现了Ku蛋白与内部核糖体进入位点序列（IRES）有相互作用。通过序列分析我们发现IRES具有典型的颈环结构和双链特征，与microRNA初始转录产物(pri-miRNA)，microRNA的前体(pre-miRNA)以及microRNA二聚体结构特征相似，那么Ku蛋白是否能够和这些RNA发生相互作用吗？　　本论文的研究在于原核表达Ku70蛋白及其相关突变体，为今后进一步开展相关工作打下基础，具体包括以下内容:　　1、H1299和H460细胞中Ku70蛋白表达量比较　　提取H1299和H460细胞总蛋白和总RNA后，利用western blot和qPCR检测两种细胞中Ku70的水平高低。western blot和qPCR结果显示H1299中Ku70在蛋白和mRNA水平均高于H460细胞。　　2、pcDNA6-Ku70、pcDNA6-Ku70Δα/β、pcDNA6-Ku70ΔDNA三个真核表达载体的构建和表达　　a.获得目的序列。合成相关引物钓取Ku70全长序列、Ku70缺失/β结构域序列、Ku70缺失DNA结构域序列。　　b.获得重组菌株。将pcDNA6载体和合成回收的DNA序列产物经相同的限制性内切酶酶切，然后经T4连接酶连接，再转化到DH5α感受态细胞中，PCR鉴定和送样测序，获得阳性克隆。　　c.得到重组质粒。提取pcDNA6-Ku70、pcDNA6-Ku70Δ/β、pcDNA6-Ku70ΔDNA三个真核表达质粒。　　d.重组质粒的表达检测。将得到的pcDNA6-Ku70、pcDNA6-Ku70Δα/、pcDNA6-Ku70ΔDNA三个真核表达质粒转染到HeLa细胞中，利用Myc标签抗体检测蛋白是否表达。　　3、pET28a-Ku70、pET28a-Ku70Δαβ和pET28a-Ku70ΔDNA原核表达表达载体构建和表达　　a.获得目的序列。合成相关引物钓取Ku70全长序列、Ku70缺失α/β结构域序列、Ku70缺失DNA结构域序列。　　b.获得重组菌株。将pET28a载体和合成回收的DNA序列产物经相同的限制性内切酶酶切，然后经T4连接酶连接，再转化到DH5α感受态细胞中，PCR鉴定和送样测序，获得阳性克隆。　　c.得到重组质粒。提取pET28a-Ku70、pET28a-Ku70Δα/β和pET28a-Ku70ΔDNA原核表达质粒。　　d.重组质粒的表达检测。将得到的pET28a-Ku70、pET28a-Ku70Δα/β和pET28a-Ku70ΔDNA三个原核表达质粒转化到BL21细菌感受态细胞中中，利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明三个重组质粒都能够表达，且表达量将近40％。　　4、纯化获取Ku70、Ku70Δ/β和Ku70ΔDNA重组蛋白　　a.诱导表达。按1∶50接种，培养2小时后开始测量细菌的OD值，当OD至达到0.6～0.8之间的时候，加入IPTG诱导，终浓度1mM。　　b.检测蛋白表达情况。37℃摇床培养4-6 h，收集菌体，取少量菌体SDS-PAGE观察检测目的蛋白的表达情况。　　c.Ni柱纯化。将收集到的菌体加入缓冲液超声破碎，离心取上清。通过1mL的Ni柱纯化目的蛋白。　　d.western blot验证纯化蛋白。将纯化得到的目的蛋白取一部分电泳，然后通过免疫印迹实验验证纯化得到的蛋白是否是所需要的目的重组蛋白。westernblot结果表明回收到的的确是构建的重组蛋白。