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【背景】胃癌是我国第二大常见的恶性肿瘤,也是我国恶性肿瘤死亡的第二大主要原因。从慢性萎缩性胃炎发展至肠上皮化生、不典型增生,最后进展成为胃癌,是胃癌尤其是肠型胃癌发生的一般模式。众多研究显示,除了幽门螺旋杆菌感染,胆汁酸刺激也与胃黏膜肠化生之间有着紧密的联系。CDX2作为一种同源盒转录因子,主要表达于结肠和小肠细胞中,它对肠道细胞的生长和分化至关重要。我们课题组前期的研究表明,胆汁酸可以在体外诱导胃细胞中CDX2和肠上皮细胞特异表达分子的表达。然而肠化生进展过程中,CDX2上调的具体分子机制尚不完全清楚。SOX2是SRY相关HMG盒家族的成员,它是食管和胃分化和维持正常表型的关键转录因子。有研究发现,肠化生组织中SOX2和CDX2具有相反的表达模式。然而,SOX2和CDX2之间的调节关系仍然存在争议。MicroRNA(miRNA)是一种内源性表达的非编码小RNA,它通过与目标mRNA的非翻译区(3’UTR)结合,发挥重要的基因调控作用。许多研究都表明,miRNA参与多种癌症的发病过程。其中,miR-21是胃癌和癌前病变中高度上调的miRNA之一。在胃癌患者中,miR-21的表达与肿瘤大小、转移和预后显著相关。基于上述报道,我们推测miR-21可能在肠化生进展过程中促进了胃细胞的表型变化。本研究旨在探讨胃细胞中SOX2和CDX2之间调控的分子机制,以及miR-21在胆汁酸诱导的肠化生过程中是否发挥调控作用。【目的】1.明确SOX2和CDX2在胃黏膜肠化生组织中的相关表达。2.探讨SOX2对CDX2的调控作用。3.研究胆汁酸诱导的miR-21对SOX2的调控作用。【方法】1.用不同浓度的脱氧胆酸(DCA)分别刺激胃细胞GES-1、AGS、AZ-521和MKN45,作用时间为24小时,Western blotting检测SOX2、CDX2和几种肠上皮细胞特异表达分子(KLF4、Cadherin 17和HNF4α)的表达。2.实时定量PCR检测搜集于西京消化病医院的8例肠化生配对标本中CDX2和SOX2的表达情况。免疫组化检测CDX2在胃肠化生组织芯片中的表达。3.免疫共沉淀法检测SOX2与CDX2是否在蛋白水平相互结合,免疫荧光法检测SOX2与CDX2在胃细胞中的定位。双荧光素酶报告基因用于检测CDX2的转录活性。通过转染慢病毒或小干扰RNA构建CDX2和SOX2的过表达和缺失模型。实时定量PCR和Western blotting检测SOX2、CDX2和肠道标志物的表达。4.实时定量PCR检测不同胃细胞系和肠化生配对标本中miR-21表达。原位杂交技术检测胃肠化生组织芯片中miR-21的表达。通过转染mimic和antagomir构建miR-21过表达和缺失模型。实时定量PCR和Western blotting检测了miR-21对SOX2表达的影响。应用双荧光素酶报告基因,在工具细胞HEK293T中进一步探究miR-21对SOX2的调控作用。【结果】1.Western blotting结果表明,100-200μM浓度的DCA刺激人正常胃黏膜细胞GES-1 24小时后,CDX2和肠上皮细胞特异表达分子(KLF4、Cadherin 17和HNF4α)显著上调。200μM浓度DCA能够显著抑制胃细胞系AGS、AZ-521和MKN45中SOX2的表达。2.Western blotting和实时定量PCR结果表明,CDX2能显著上调KLF4、Cadherin17和HNF4α的表达,而SOX2对这三种肠上皮细胞特异表达分子没有直接的调控作用。在组织芯片中,免疫组化结果表明,与正常组织相比,肠化生组织中CDX2的表达水平明显升高,结果具有统计学意义(P<0.01)。实时定量PCR结果表明,在8对配对肠化生组织中,CDX2在肠化生组织中高表达,而SOX2在正常胃黏膜组织中高表达(P<0.01)。3.Western blotting结果表明,CDX2诱导表达的KLF4、Cadherin 17和HNF4α在共转染SOX2和CDX2过表达慢病毒载体的GES-1中显著降低。此外,实时定量PCR也表明,SOX2能够抑制CDX2过表达慢病毒载体感染的GES-1细胞中KLF4的表达。在表达内源性SOX2和CDX2的AGS细胞中,转染SOX2小干扰RNA后,CDX2诱导表达的KLF4、HNF4α和Cadherin 17进一步上调。Western blotting和实时定量PCR显示,与对照组相比,转染SOX2过表达慢病毒的GES-1细胞中,DCA诱导的KLF4表达显著降低。转染SOX2小干扰RNA的AGS细胞中,DCA诱导的KLF4的表达进一步增加。双荧光素酶报告基因试验表明,SOX2对CDX2的转录活性有较强的抑制作用。4.免疫共沉淀分析表明,AGS中内源性SOX2和CDX2可以在蛋白质水平形成复合物。此外,免疫荧光结果表明SOX2和CDX2在AGS和AZ-521细胞的胞核中存在共定位。5.Western blotting结果显示,转染miR-21类似物后,AGS和AZ-521细胞中SOX2的表达被明显抑制,而转染miR-21的拮抗物后,AGS和MKN45细胞中SOX2的表达明显上调。实时定量PCR分析显示,转染miR-21类似物或拮抗物的实验组中,SOX2在mRNA水平保持不变。双荧光素酶报告基因试验证实,miR-21可通过直接结合SOX2的3’UTR区来抑制SOX2的表达。实时定量PCR表明,DCA处理24小时后,GES-1和AZ-521细胞中的miR-21表达均显著增加,且上调程度与DCA浓度正相关。在8对配对肠化生标本中,实时定量PCR显示,肠化生组织中miR-21表达显著高于正常胃黏膜组织(P<0.01)。免疫组化结果也证明,在由141例肠化生和62例正常胃组织构成的组织芯片中,miR-21在肠化生组织中的表达显著高于正常胃黏膜组织(P<0.01)。Western blotting结果表明,通过在AGS细胞中转染miR-21的拮抗物,被DCA抑制的SOX2表达可被部分挽救。【结论】在胃上皮细胞内,SOX2通过与CDX2形成复合物抑制后者对下游靶分子的转录活性,而miR-21能直接结合SOX2的3’UTR区域而抑制其表达。接受胆汁酸刺激后,胃上皮细胞一方面上调CDX2的表达水平,另一方面通过上调miR-21抑制SOX2的表达,并进而解除SOX2对CDX2的抑制作用,最终增强CDX2的活性,促进肠型标志分子的表达和肠化生的发生发展。