来自豆豉的纤溶酶具有溶栓效果好、安全及廉价等优点，是潜在的新一代溶栓药物。从分子水平上开展豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE)的研究，可利用基因工程技术大量生产制备豆豉纤溶酶，还可对其进一步改造以提高其作为药物的特性。本研究在获取豆豉纤溶酶基因序列基础上，通过优化表达体系，提高了DFE在枯草杆菌中的重组表达水平，并通过定点突变提高了DFE的纤溶酶活力和对血纤溶酶最适合成底物的特异性。 从来源于豆豉的纤溶酶菌株枯草杆菌DC12的DNA中PCR扩增分离到纤溶酶基因序列，将扩增片段经TA克隆到pMD18-T simpie载体上。测序结果表明，获得的DFE基因与枯草杆菌蛋白酶BPN和豆豉溶栓酶的基因序列同源性分别达96.3％和99.0％；氨基酸序列同源性分别达97.0％和99.3％。从质粒pMD18-DFE将启动子至3’非翻译区1.4kb的全长DFE基因序列亚克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE<,3>，构建了DFE基因的表达质粒并化学转化枯草杆菌168和WB800。DFE基因在自身启动子驱动下，在枯草杆菌中获得了重组分泌表达。表达菌株B.subtilis 168/pBE-DFE培养物上清液中的纤溶酶活性为130U/mL，而表达菌株B.subtilis WB800/pBE-DFE的纤溶酶活性最高达690U/mL。 重组菌B.subtilis WB800/pBE-DFE的发酵液经离心除菌，硫酸铵分段盐析、透析及CM-Sepharose Fast Flow凝胶层析纯化步骤，获得电泳纯的DFE。SDS-PAGE结果显示表达的DFE分子量为28KDa左右，经纤维蛋白自显影证实表达产物具有纤维蛋白水解活性。酶学性质研究表明：DFE在温度不超过50℃稳定，最适作用温度为44℃；在pH值6～10范围内稳定，其最适反应pH值为9.0。PMSF能完全抑制酶活性，而EDTA和EGTA不能抑制酶活性，表明DFE具有丝氨酸蛋白酶的特性。 为了实现在枯草杆菌中高水平表达DFE，将来源于枯草杆菌168的强启动子P43序列以及转录终止信号序列通过PCR重叠延伸融合，融合序列克隆到载体pBE<,3>中，构建了含P43启动子的新载体pBEP43。将DFE基因插入载体pBEP43并在枯草杆菌WB800中表达，在P43启动子驱动下，重组菌中对数生长期和平衡期均能表达分泌DFE。重组菌经培养后上清夜中的纤溶酶活性最高达1270 U/mL，是DFE基因在自身启动子驱动下表达活性的1.87倍和野生菌株枯草杆菌DCl2纤溶活性的4.1倍。从枯草杆菌168中扩增获得SacB基因启动子序列，并以其取代载体pBEP43-DFE中的P43启动子，构建了含SacB基因启动子的DFE基因表达载体。DFE基因在蔗糖诱导性启动子SacB驱动下，重组菌在含2％蔗糖的LB培养基中诱导表达42h的纤溶酶活性为420U/mL。采用反向长距离PCR技术进行定点突变，分别替换了DFE基因成熟肽编码区的三个氨基酸：将156位谷氨酸替换为丝氨酸(E156S)，166位和169位的甘氨酸均替换为丙氨酸(G166A，G169A)。三个DFE突变体重组菌WB800(E156S)、WB800(G166A)和WB800(G169A)发酵上清液的纤溶酶活性分别为460U/mL；790U/mL和900U/mL，是未突变酶的70％；115％和136％；突变酶对合成底物p-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性分别为未突变酶的17％，125％和121％。 通过研究培养基成分对重组菌WB800(G169A)表达DFE的影响发现：在LB培养基中添加葡萄糖会抑制重组菌分泌。DFE，且抑制程度随着葡萄糖浓度的增加而加强。不同氨基酸对重组菌DFE分泌的影响效应不同：谷氨酸、天冬氨酸对重组菌的生长和DFE分泌均有抑制作用，使发酵24h酶活性下降60％；而缬氨酸、赖氨酸对DFE分泌具有较好的促进作用，酶活性分别提高40％和20％；添加丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的复合物以及丝氨酸可分别提高酶活性20％和10％；色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的复合物及组氨酸则对DFE的分泌没有影响。低分子量的阳离子复合物对重组菌产酶具有促进作用，可使酶的酶活性提高40％。将具有促进效应的氨基酸和阳离子复合物联合应用则能使重组菌的产酶量提高70％，达1550U/mL。