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背景和目的:慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)发病率和死亡率呈逐年上升趋势,疾病负担重,但其具体发病机制不清。研究发现,肺泡巨噬细胞(AM)吞噬功能下降是慢阻肺急性加重的重要原因之一,AM吞噬过程主要与细胞骨架重排有关;另有研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-Ras同源基因家族成员A(RhoA)信号通路参与调控细胞骨架重排,但PI3K-mTOR-RhoA信号通路调控细胞骨架重排与巨噬细胞吞噬能力的研究鲜见报道,故本研究采用基因干扰(RNAi)技术沉默该通路的PI3K、mTOR蛋白,探讨PI3K-mTOR-RhoA信号通路调控细胞骨架重排与巨噬细胞吞噬能力的关系及其具体机制。方法:培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,实验分为4组:空白组(不进行转染)、阴性对照组(用含随机序列的短发夹RNA,即shRNA转染细胞)、沉默PI3K基因组(PI3K-RNAi组)和沉默mTOR基因组(mTOR-RNAi组)。蛋白印迹法(Western blot)检测基因沉默效率;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应检测PI3K、mTOR、RhoA的mRNA水平;Western blot检测PI3K、mTOR、RhoA和磷酸化RhoA(p-RhoA)蛋白的表达;激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架形态;流式细胞术检测细胞吞噬异硫氰酸酯荧光素标记大肠杆菌(FITC-E.coli)的能力,平均荧光强度(MFI)和吞噬阳性细胞百分比(吞噬%)代表吞噬能力的强弱。结果:1.基因沉默效率:PI3K和mTOR的基因沉默效率分别为(62±7)%、(61±8)%。2.各组PI3K、mTOR、RhoA的mRNA和蛋白及磷酸化RhoA(p-RhoA)蛋白表达:(1)PI3K-RNAi组PI3K、mTOR、RhoA的mRNA、蛋白表达和p-RhoA[(0.29±0.07、0.38±0.02)、(0.54±0.13、0.72±0.02)、(0.59±0.06、0.74±0.03)和0.68±0.02]均低于空白组[(1.00±0.00、1.00±0.04)、(1.00±0.00、1.00±0.04)、(1.00±0.00、1.00±0.04)和1.00±0.06]和阴性对照组[(0.98±0.05、1.00±0.04)、(1.01±0.11、1.01±0.08)、(0.99±1.03、1.00±0.04)和1.03±0.07](均Р<0.01);(2)mTOR-RNAi组mTOR的mRNA、蛋白表达(0.30±0.08、0.39±0.02)均较空白组、阴性对照组减低(均Р<0.01),RhoA的mRNA、蛋白和p-RhoA蛋白表达[(1.40±0.21、1.54±0.04)和1.33±0.01]较空白组和阴性对照组升高(均Р<0.01)。3.各组细胞骨架形态变化:PI3K-RNAi组细胞形态僵硬,丝状伪足伸出短小、杂乱,应力纤维数量减少;mTOR-RNAi组细胞变形更为明显,丝状伪足伸出更细长而密集,应力纤维数量明显增加;空白组和阴性对照组细胞变形较明显,丝状伪足伸出较长,应力纤维数量较多。4.各组细胞吞噬FITC-E.coli的能力:PI3K-RNAi组MFI及吞噬%[7435±705、(70.73±2.66)%]均较空白组[11733±935、(79.97±1.07)%]和阴性对照组[10983±954、(79.60±1.17)%]减低(均Р<0.01);mTOR-RNAi组MFI及吞噬%[18583±1090、(87.72±1.58)%]均较空白组和阴性对照组增加(均Р<0.01);空白组和阴性对照组MFI及吞噬%无差异(Р>0.01)。5.相关性分析:RNAi沉默前后,各组细胞PI3KmRNA、蛋白表达与mTORmRNA、蛋白表达呈正相关(均Р<0.05);PI3KmRNA、蛋白表达与RhoAmRNA、蛋白、p-RhoA蛋白表达呈正相关(均Р<0.05);mTORmRNA、蛋白表达与RhoAmRNA、蛋白、p-RhoA蛋白表达呈负相关(均Р<0.05);PI3K、RhoA的mRNA和蛋白表达和p-RhoA与MFI和吞噬%均呈正相关(均Р<0.05);mTOR mRNA和蛋白与MFI和吞噬%均呈负相关(均Р<0.05)。结论:1.慢病毒转染法可以成功沉默PI3K、mTOR基因;2.细胞骨架重排与巨噬细胞吞噬能力改变有关;3.PI3K-m TOR-RhoA信号通路调控细胞骨架重排;4.PI3K正性调控mTOR-RhoA通路,促进细胞骨架恰当重排,增强巨噬细胞吞噬能力;mTOR负性调控该通路,抑制细胞骨架恰当重排,减弱巨噬细胞吞噬能力。