核糖体展示技术是一种新型体外筛选分子进化功能性蛋白质的强有力的工具。该技术将基因型和表型联系在一起,无细胞环境下形成三元复合物mRNA-核糖体-蛋白质,进而从蛋白展示文库中找到编码针对目标蛋白的基因序列,这已成功应用于scfv抗体库的构建和筛选。纳米抗体具有分子小,水溶性高,稳定性强,免疫原性低等多种优势,已在实验和医疗研究中展现出良好的应用前景。本课题通过核糖体展示技术构建了一个高容量的天然纳米抗体文库,并针对低氧诱导因子-1α的PAS-B(HIF-1α-PAS-B)结构域进行了高效的筛选,既验证了核糖体展示文库的可行性,又为新型抗体药物的发现奠定了基础。本实验选自澳洲羊驼外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA 10.4ug进行RT-PCR得到cDNA文库。利用PCR扩增VHH片段和间隔序列(geneШ,来自辅助噬菌体M13KO7),同时引入核糖体展示元件、酶切位点、组氨酸标签等。然后,采用重叠延伸PCR,将VHH片段和间隔序列重组构建核糖体展示纳米文库。通过测序鉴定,文库多样性和完整性显示良好,有效库容量为4.9×1012。同时经体外转录翻译试剂盒经Western-blot初步鉴定文库可以正常翻译。利用pGEX-4T-1-HIF-1α-PAS-B表达载体成功表达GST-HIF-1α-PAS-B蛋白,经GST亲和层析获得该融合蛋后经凝血酶酶切、纯化,成功获得具有筛选质量的抗原分子HIF-1α-PAS-B蛋白。最后利用核糖体展示技术进行四轮筛选,通过RT-PCR验证特异性抗体基因序列得到了有效富集。将筛选到的抗体片段克隆至噬菌粒载体Pcantab5E进而转化TG1,进行Phage Elisa鉴定与抗原结合的特异性,初步获得了针对HIF-1α的特异性纳米抗体。