副溶血性弧菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其在三文鱼中的靶向抑菌作用

来源 :扬州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Robert_1967
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副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是海产品主要病原菌之一,食用被该菌污染的海产品可引起肠胃炎、发烧等症状,严重影响人类健康。为了探索在室温条件下控制海产品中副溶血性弧菌的有效方法,本研究以Vp为宿主菌,从扬州市污水中分离出5株裂解性噬菌体,并研究了其生物学特性、噬菌体杀菌剂的制作及其在生物防治方面的应用,为开发新型Vp杀菌剂奠定基础。研究结果如下:(1)从扬州市污水中分离出30株Vp噬菌体,筛选出裂解性好的5株噬菌体进行后续研究。透射电镜观察其形态有长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科、盖噬菌体科。噬菌体在60℃及pH 4~10条件下活性稳定。裂解谱实验结果显示VppYZU81裂解谱最宽,能裂解25株宿主菌;5株噬菌体制成的VppMIX能裂解43株宿主菌。一步生长曲线和最佳感染复数的研究表明了噬菌体裂解性的差异性。(2)对5株噬菌体的全基因组进行了测序,结果显示,5株Vp噬菌体均为新的噬菌体。噬菌体 VppYZU64、VppYZU68、VppYZU81、VppYZU92、VppYZU110 基因组全长分别为 76,153 bp、58,495 bp、42,897 bp、80,670 bp、144,768 bp;编码基因平均长度分别为 663.96 bp、698.81 bp、915.00 bp、654.18 bp、931.20bp,分别有 100、27、40、114、35个开放阅读框。功能基因主要有调控核酸代谢和表达的基因、结构蛋白基因、组装蛋白基因、裂解相关基因。(3)将噬菌体和柠檬酸联合组成的杀菌剂分别在25℃、37℃条件下,在培养基及三文鱼片中的抑菌效果进行评价。25℃培养基中,500 μg/mL柠檬酸(pH 5.70)与106 PFU/mL VppYZU64联合抑制宿主菌时,对照组培养8 h菌落总数起始的3.11 lgCFU/mL上升至最低致病剂量(5.00 lgCFU/mL),柠檬酸处理组、噬菌体处理组、联合处理组分别在14 h、16 h、22 h菌落总数上升至105 CFU/mL,噬菌体与柠檬酸有联合抑菌效果。而pH 5.70的HCI与VppYZU64联合抑制宿主菌时,盐酸处理组、联合处理组分别在11h、16h菌落总数上升至105 CFU/mL。盐酸抑菌效果低于柠檬酸,与噬菌体联合时抑菌效果也不明显。25℃条件下将500 μg/mL柠檬酸与噬菌体混合物VppMIx联合作用于宿主菌混合物VpMIx,联合处理组培养31 h菌落总数上升至5.00 lgCFU/mL。VppMIx与柠檬酸联合作用抑菌效果优于单一噬菌体与柠檬酸联合作用,其抑菌时间延长了 4 h。(4)将三文鱼片蘸取梯度浓度的柠檬酸溶液经感官评价确定其适宜浓度为600μg/mL,将该浓度柠檬酸与VppMIx(106 PFU/mL)联合作用于感染了 VpMIx(104 lgCFU/mL)的三文鱼片。三文鱼片在25℃储藏6 h柠檬酸处理组(BA)、噬菌体处理组(BP)、联合处理组(BPA)菌落数分别下降了 0.59 lgCFU/g、2.02 lgCFU/g、3.84lgCFU/g(P<0.05);各实验组分别在11h、16h、23h菌落总数上升至5.00 lgCFU/g。37℃储藏3h,BA、BP、BPA 实验组的菌落总数分别下降了 0.83 lgCFU/g、3.31 lgCFU/g、3.42 lgCFU/g(P<0.05);各实验组分别在4、7、10h达到10sCFU/g。噬菌体和柠檬酸联合显著的抑制了副溶血性弧菌的生长,延长了三文鱼片的储藏时间。VppYZU64与600μg/mL柠檬酸联合抑制生物膜时,联合处理组生物膜抑制率高达93.80%,扫描电镜观察结果也显示联合处理组生物膜残留量最少。(5)通过测定噬菌体的不敏感突变频率(Bacteriophage insensitive mutants,BIMs),结果显示单一噬菌体的BIMs在10-3~10-5,VppMIX的BIMs频率下降至10-6。VppYZU64的35株不敏感菌株经20次传代以后,有25株又恢复了对噬菌体的敏感性。分离的一株不敏感突变株VPYZU64-1与亲本菌株VPYZU64相比较菌落边缘较小,扫描电镜观察VPYZU64-1细胞表面有皱缩现象。
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