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目的观察活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜病变的影响,并从TGF-β/Smads信号转导通路调控基质代谢的角度探讨其改善糖尿病大鼠视网膜病变可能的作用机制,以便进一步明确DR的发病机制,为临床DR的防治提供有效的方法和思路。方法1.腹腔内一次性注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,按血糖、体重随机分为模型组、活血解毒方低剂量组、活血解毒方中剂量组、活血解毒方高剂量组和羟苯磺酸钙组,每组20只,另设正常对照组15只。第19周时电镜检查,确定视网膜已发生病变后开始给药,每天灌胃一次,持续12周。对大鼠进行一般状况观察,每周检测体重,每4周检测血糖。2.病程32周时,采用高分辨率小动物超声影像系统检测各组大鼠视网膜中央动静脉血流动力学参数的改变情况,观察活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜血流动力学的影响。3.病程32周后,腹腔注射戊巴比妥钠以麻醉大鼠,腹主动脉取血并处死,摘除大鼠右侧眼球,将视网膜剥离出来并剪成三瓣,分别固定于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛磷酸缓冲液中。应用视网膜血管消化铺片技术和石蜡切片HE染色技术观察视网膜病理组织结构的改变情况；应用透射电镜观察视网膜超微结构的改变情况。4.病程32周后,腹腔注射戊巴比妥钠以麻醉大鼠,腹主动脉取血并处死,摘除大鼠左侧眼球,剥离出视网膜-80℃冻存。采用Real-time PCR法检测各组大鼠视网膜中TGF-β2 mRNA、Smad-2mRNA和Smad-7 mRNA的表达。5.取-80℃冻存的视网膜,应用Western blot法检测各组大鼠视网膜中MMP-9、 MMP-2蛋白的表达。6.取石蜡切片,应用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原的表达。结果1.一般状况观察：糖尿病模型组大鼠表现为多饮、多食、多尿,且体态逐渐消瘦,呈典型的“三多一少”症状,伴随有耳廓和爪甲干枯苍白、大便稀溏腐臭、体毛枯黄杂乱、颈背部体毛潮湿易脱落、精神萎靡、易惊易躁等特点。活血解毒方各剂量组大鼠的生存状态与同期模型组相比明显改善,体毛脱落减少,饮水量及尿量减少,大便稀溏状态有所缓解,各剂量组间的差别不明显。2.体重变化情况：正常组大鼠的体重随着周龄的增长而稳步增加；模型组和各给药组大鼠体重增长缓慢,较同一时间点的正常组大鼠体重均明显减轻,差异有统计学意义(P<0.05)；而模型组与各给药组之间比较无差异(P>0.05)。3.血糖变化情况：正常组大鼠的血糖比较稳定,一直维持在较低的水平,没有出现高血糖的表现。模型组和各给药组大鼠的血糖一直处在较高的水平,较同一时间点正常组大鼠血糖值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而模型组与各给药组比较无差异(P>0.05)。4.血流动力学参数的改变：各组大鼠眼底高频率超声检测结果显示,与正常组相比,模型组搏动指数(PI)、阻力指数(RI)升高,收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期末期流速(EDV)、平均血流速度(MV)及中央静脉血流速度(CRV)降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,活血解毒方各剂量组的搏动指数(PI)均有下降,差异有统计学意义(P<0.05),尤其活血解毒方高剂量组的阻力指数(RI)下降,收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期末期流速(EDV)、平均血流速度(MV)均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.视网膜血管消化铺片形态学的改变：模型组视网膜血管网扭曲而排列紊乱,分布不均匀,毛细血管管径粗细不一致,并可见毛细血管瘤,其中周细胞数量明显减少,内皮细胞呈局灶性或弥漫性增生；毛细血管面积密度和内皮细胞数与周细胞数比值较正常组显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。活血解毒方各剂量组毛细血管的分布比较均匀,血管形态较为规则有序,内皮细胞的增生不明显,未见丛状毛细血管、血管瘤和凋亡小体；毛细血管面积密度和内皮细胞数与周细胞数比值较模型组有所下降,差异有统计学意义(P<0.05),尤其活血解毒方中剂量组的效果最为明显。6.HE染色视网膜形态学的改变：模型组视网膜各层组织均有水肿,组织结构疏松。神经纤维层丢失,神经节细胞层细胞数量明显减少,内丛状层和外丛状层水肿,内核层细胞排列紊乱、细胞数量减少,视网膜可见圆点状或火焰状出血,边界模糊不清。活血解毒方各剂量组大鼠视网膜病变较模型组有明显改善,视网膜各层排列较为整齐均匀,部分层次有轻微水肿,偶见微小出血点,未观察到新生血管的出现。7.电镜下视网膜超微结构的改变：模型组视网膜毛细血管中内皮细胞明显肿胀变形,细胞核形态不规则,内皮细胞向血管腔内指状突出,使得管腔狭窄甚至闭塞,尤其可见毛细血管基底膜增厚较为明显。活血解毒方各剂量组视网膜的血管基底膜有阶段性增厚但不明显,内皮细胞连接紧密,管腔较为平滑变形不明显。8. Real-time PCR检测结果：模型组TGF-β2 mRNA及Smad-2 mRNA表达均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05), Smad-7 mRNA表达低于正常组,但差异无统计学意义(P>0.05)；活血解毒方组TGF-β2 mRNA及Smad2 mRNA表达低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05),Smad-7 mRNA表达高于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。9. Western blot检测结果：模型组MMP-9、MMP-2蛋白表达均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)；活血解毒方组MMP-9、MMP-2蛋白表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。10.免疫组织化学法检测结果：Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原阳性细胞表现为胞浆着色呈棕褐色,镜下可见：正常组大鼠视网膜中Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原表达低,呈淡棕色；模型组：Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原表达升高,呈深棕褐色；活血解毒方组：Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原表达呈淡褐色,较模型组表达降低。结论1.活血解毒方能够改善STZ性糖尿病大鼠的生存状态,缓解糖尿病的症状,但对大鼠的体重和血糖无明显影响。2.活血解毒方可以降低大鼠视网膜的血管外周阻力、提高血流速度,增加视网膜血液灌注,从而改善糖尿病大鼠的微循环障碍,保护视网膜血管,延缓DR病变进一步发展。3.活血解毒方能够抑制内皮细胞增殖,减少新生血管形成；改善视网膜各层间组织水肿,缓解视网膜的病理损害；并能够抑制基底膜胶原合成增多,减少基质沉积,抑制基底膜增厚,提示活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜病变有一定的改善作用。4.活血解毒方能够下调TGF-02和Smad-2基因的表达,干预TGF-β2/Smads信号转导通路调控基质代谢,下调MMP-9、MMP-2、I型胶原、Ⅳ型胶原的表达,从而改善DR基底膜增厚、新生血管增殖的状况,保护视网膜组织,这可能是活血解毒方改善糖尿病大鼠视网膜病变的作用机制。