2个烟草青枯菌基因组比较及噬菌体orf30功能分析

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由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病是烟草上的重要细菌病害,给烟草行业带来巨大损失,目前尚未有效的防治措施。噬菌体作为细菌病毒,能有效裂解青枯菌,但由于噬菌体存在高度特异性等问题,影响其防治细菌病害的效果。因此,研究噬菌体与细菌之间的互作,探究噬菌体抗性菌株的抗性机制,对于利用噬菌体防治作物青枯病具有重要意义。为明确青枯菌可能存在的抗噬菌体机制,将对6个噬菌体P1556-1、P1556-2、P7-1、P1521、P1553和P574表现敏感和不敏感的2个青枯菌Tb15和Tb1546进行全基因组测序,5大数据库注释,系统发育分析,致病因子、基因岛、前噬菌体、CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)序列及差异基因等预测和比较;同时对I型R-M系统(Restriction-modification system)及hsd S基因进行敲除验证。基因组测序分析结果显示:Tb15大小为5.83 Mb(染色体为3.82 Mb,质粒为2.00Mb),GC含量66.87%,预测基因5151个;Tb1546大小为5.58 Mb(染色体为3.63Mb,质粒为1.94 Mb),GC含量为67.20%,预测基因4925个。16S r DNA和看家基因系统发育分析,表明Tb15和Tb1546均属演化型I,与来自中国重庆的烟草青枯菌株CQPS-1更密切,共线性分析显示,Tb15与CQPS-1染色体具有一致的方向性,但质粒方向不一致。Tb15和Tb1546均有20个基因岛,分别含有6个和4个完整的前噬菌体区域,但抗性菌株Tb15基因组更大,各类致病因子和CRISPR序列更多。基因差异显示Tb15含有445个特有基因,其中Cro/CI型的阻遏蛋白与噬菌体抗性可能相关。另外,COG防御机制中特有的8个基因,含有完整的I型R-M系统,也与噬菌体抗性相关。R-M系统基因敲除结果显示,突变体ΔRM和Δhsd S对P7-1敏感,但对其它噬菌体依旧表现为抗性,证明在Tb15中还存在其它抗性机制。此外,为了明确噬菌体P574中的orf30基因功能,本论文首先克隆该基因,并将其转化至青枯菌Tb1546和Tb15中,比较转化菌株和野生菌在生长曲线、菌落形态、胞外多糖、纤维素酶活性、致病力以及对不同噬菌体的产斑效率(Efficiency of plating,EOP)、吸附率及噬菌斑大小等差异,进一步q RT-PCR进行基因表达分析。结果表明,orf30基因属于XRE家族的转录调节因子,转化了orf30的青枯菌株(orf30-Tb1546和orf30-Tb15)几乎丧失了致病力。转化菌株在LB中的生长速度加快,TTC平板上菌落形态干燥扁平,呈深红色,胞外多糖产量下降,纤维素酶活性降低。q RT-PCR结果表明,orf30能够调控phc系统及多个双组分系统,从而影响青枯菌的致病性。噬菌体相关生物学试验结果表明,除噬菌体P1556-1外,转化orf30的青枯菌对其它5个噬菌体的吸附率均受到不同程度的影响;orf30增强了Tb1546对6个噬菌体的裂解能力,且消弱了Tb15对P7-1和P1553的抗性,即抗性变为敏感。EOP结果表明,除P7-1和P1553在orf30-Tb1546平板上的产斑效率不变外,其它噬菌体的产斑效率均下降,以P1556-2和P574最显著。
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